一种用于肝素粗品质量监测的、检测原料药中反刍动物DNA的多重RT-PCR分析方法的开发
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作者
Sharla M. Peters1, Yolanda L. Jones1, Frank Perrella2, Tai Ha3, and Haile F. Yancy1
1U. S. Food and Dru g Administration, Center for Veterinary Medicine,Office of Research, 8401 Muirkirk Road, Laurel, Maryland 20708, USA. 2U.S. Food and Dru g Administration, Center for Dru g Evaluation andResearch, Office of Compliance, Silver Sprin g, MD 20993, USA. 3Nebraska Department of A griculture, 301 Centennial Mall South, Lincoln,Nebraska 68508, USA.
摘要
我们开发了一种检测猪源肝素钠粗品中的反刍动物源污染的实时荧光定量PCR技术。该检测法由一套针对反刍动物（牛、绵羊、山羊）和猪的冻干引物、探针及扩增内标组成。该方法经过两处分析机构验证：第一个位于FDA，第二个位于某州独立实验室。
肝素钠多重实时荧光定量PCR（hMRTA）检测方法性能通过了美国FDA兽药中心研发处制定的特异性、灵敏度和专一性严格验收标准。符合早前建立的饲料中反刍动物原料多重实时荧光定量PCR检测法的灵敏度和重复性要求。
hMRTA法检测猪源肝素钠粗品，98%达灵敏度，真阳性98%、假阴性2%。PCR检测法检测三个反刍动物物种，可作为判定猪属来源的初步筛选、复查确认工具。进一步保证肝素钠粗品质量，帮助识别控制肝素钠生产来源物种。对粗品肝素钠来源的控制对确保含肝素钠药物和耗材的安全性以及保护公众健康至关重要。
引言
FDA的工业指南草案《药物及医疗设备用途肝素：粗品肝素质量监管》（Heparin for Dru g and Medical DeviceUse: Monitorin g Crude Heparin for Quality）就粗品肝素污染的可能风险对活性药物成分（APIs）制造商、药物和医疗设备的成品制造商、分装商及其他相关方进行了警告。
该指南草案提供了数个推荐项目，它们将帮助API制造商、药物及医疗设备成品制造商、分装商及其他相关方更好地控制可能含有过硫酸软骨素（OSCS）或非猪原料（特别是反刍原料）污染的粗品肝素的使用。
除其他事项外，该草案推荐，接收和使用粗品肝素来生产药物和医疗设备的生产商或医疗设备制造商，在制造含肝素的药物或医疗设备前，应检测并确认每批粗品肝素的动物来源。
检测方法应当通过资格认证，且应基于良好的科学原则（例如足够的准确性的特异性），拥有与当前科学认知和评估状况相称的灵敏性。以下是一种使用实时聚合酶链式反应（PCR，hMRTA）测定粗品肝素中反刍动物污染物的分析方法。
此法已使用猪源粗品肝素和牛标准物进行了适应性评估。可用于鉴别猪源粗品肝素中的反刍DNA。本草案提供了RT-PCR法检测猪粗品肝素中反刍原料的详细方法、所需试剂和设备。其他合适的替代方法也可进行资格验证，以用于检测粗品肝素中的反刍原料。
材料及方法
建议每批待测样品（提取、纯化和PCR）都设立阴性对照。并同时给每批Bio gX Ruminant and Porcine Beads设置商业化基因组DNA（牛、猪、山羊、绵羊）阳性对照。
1. DNA提取
介绍:
下面是从0.5 ml干燥粗品肝素中提取DNA的方法说明。请在提取操作开始前通读整篇标准操作流程。本方法使用了Invitro gen(Carlsbad, CA)生产的Char geSwitch® gDNA Rendered Meat PurificationKit。
所有的试剂、枪头和离心管均为DNase free。枪头需有气溶胶抗性（Aerosol resistant），减少从DNA提取到PCR扩增过程中样品之间的交叉污染。因处理的是粉状物质，建议步骤1、2带上口罩，并与DNA提取、纯化和PCR地点隔离。
注意：粗品肝素钠的 PCR 检测需在其它会影响 DNA 完整性的任何前处理（如化学氧化）前进行，以免影响 PCR 物种检测结果。
1.1. 所需材料：
试剂盒：
Char geSwitch® gDNA Rendered Meat Purification Kit (Product #CS400-100)
PowerClean® DNA Clean-Up Kit (MOBIO Product# 12877-50)
Bio gX Ruminant and Porcine Beads (Product # 204-0002)
设备要求:
Micro centrifu ge
Heat Block
Nuclease Free Water
Vortex
Invitro gen Ma gna Rack
2.0 ml Tubes
Smart-Cycler
Smart Cycler centrifu ge
Smart Cycler coolin g block
SmartCycler 25 μL reaction tubes
1.2. 操作步骤
a. 加入混匀的肝素钠样品到2 ml离心管的0.5 ml标记线。
~undefined关键步骤：每次只加一个样，前一个样品加样完成前不能打开下一个离心管。
b. 加入1 ml Char geSwitch Lysis Buffer到样品中。往离心管加入裂解缓冲液时，离心管稍微倾斜。
c. 每样加入100 μL Char geSwitch SDS。涡旋5s混匀。
d. 95 ℃孵育（水浴或加热箱）5 min。
e. 每样加入400 μL Char geSwitch Precipitation Buffer（N5）。涡旋5 s混匀。
f. 冰浴离心管5 min沉淀蛋白。
g. 室温16100 g离心5 min。
h. 转移1200 μL上清液到一个新的离心管中。
i. 涡旋装有Char geSwitch Ma gnetic Beads的离心管，充分重悬浸泡在储存缓冲液中的磁珠。
j. 加入200 μL Char geSwitch Deter gent到含上清液的离心管中。
k. 加入40 μL充分重悬的Char geSwitch Ma gnetic Beads。
l. 上下吹打5次混匀。
m. 室温孵育1min。
n. 把离心管放到Ma gnaRack上直至Char geSwitch Ma gnetic Beads形成紧密沉淀，上清变清澈（约1 min）。
o. 离心管留在磁铁上，小心吸掉上清不搅浑沉淀。吸取上清时枪头不要对着沉淀物。
p. 从磁铁取下离心管。
q. 加入1 ml Char geSwitch Wash Buffer到离心管，上下吹打5次混匀。
r. 把离心管放到Ma gnaRack上直至Char geSwitch Ma gnetic Beads形成紧密沉淀，上清变清澈（约1 min）。
s. 离心管留在磁铁上，小心吸掉上清不搅浑沉淀。吸取上清时枪头不要对着沉淀物。
t. 从磁铁取下离心管。
u. 加入750 μL Char geSwitch Wash Buffer到离心管，上下吹打5次混匀。
v. 把离心管放到Ma gnaRack上直至Char geSwitch Ma gnetic Beads形成紧密沉淀，上清变清澈（约1 min）。
w. 离心管留在磁铁上，小心吸掉上清不搅浑沉淀。吸取上清时枪头不要对着沉淀物。
x. 加入750 μL Char geSwitch Wash Buffer到离心管，上下吹打5次混匀。
y. 把离心管放到Ma gnaRack上直至Char geSwitch Ma gnetic Beads形成紧密沉淀，上清变清澈（约1 min）。
z. 离心管留在磁铁上，小心吸掉上清不搅浑沉淀。吸取上清时枪头不要对着沉淀物。最后一次清洗，吸掉所有上清。
aa. 从磁铁取下离心管，此时管内不应有上清液。
bb. 加入75 μL Char geSwitch Elution Buffer（E5）到离心管。
cc. 轻轻上下吹打10次重悬Char geSwitch Ma gnetic Beads。
dd. 室温孵育1 min。
ee. 把离心管放到Ma gnaRack上直至Char geSwitch Ma gnetic Beads形成紧密沉淀，上清变清澈（约1 min）。
ff. 离心管留在磁铁上，小心转移含有DNA的上清到一个新的灭菌了的2 ml离心管中，勿搅动沉淀。吸取上清时，枪头不要对着沉淀。
g g. 弃去用过了的Char geSwitch Ma gnetic Beads。
~undefinedDNA -20 ℃冷冻保存或继续进行DNA纯化去杂质
2. DNA纯化
介绍：
下文描述了如何去除以上提取的肝素钠粗品DNA中PCR抑制因子（如肝素）。在纯化去杂质开始前需通读整篇标准操作流程。本段使用MOBIO（Carlsbad, CA）的PowerClean®DNA Clean-Up Kit。试剂盒提供的所有试剂盒离心管均DNase free。
2.1. 操作步骤
a. 加入75 μL nuclease free水到DNA样品中。
b. 加入750 μL PowerClean DNA Solution 1到DNA中。上下颠倒3-5次混匀。
c. 加入20 μL PowerClean DNA Solution 2，上下颠倒3-5次混匀。
注意：检查PowerClean DNA Solution 2，若有沉淀，60 ℃水浴并轻摇直至沉淀全部溶解。不要剧烈摇晃以免产生大量泡沫。可趁热使用。
d. 加入85 μL PowerClean DNA Solution 3，上下颠倒3-5次混匀。4 ℃孵育5 min。
e. 室温10000 g离心1 min。
f. 避开沉淀，转移所有上清到一个干净的2 ml Collection Tube（试剂盒提供）中。
g. 加入70 μL PowerClean DNA Solution 4，上下颠倒3-5次混匀。4 ℃孵育5 min。
h. 室温10000 g离心1 min。
i. 避开沉淀，把上清转移到一个干净的2 ml Collection Tube（试剂盒提供）中。
j. 摇匀PowerClean DNA Solution 5。加入800μL PowerClean DNA Isolation 5到上清中，涡旋5s混匀。
k. 加载600 μL上清液到Spin Filter中，室温10000 g离心1 min。
l. 弃去滤液，把剩余的600 μL上清都加到Spin Filter上，室温10000 g离心1 min。
m. 弃去滤液。加入500 μL PowerClean DNA Solution 6到Spin Filer，室温10000 g离心30 s。
n. 弃去滤膜。
o. 室温13000 g离心2 min。
p. 小心把Spin Filter转移到一个新的2 ml Collection tube（试剂盒提供）中。避免沾到任何PowerCleanDNA Isolation 6。
q. 加入75 μL PowerClean DNA Solution 7到白色滤膜中心。
r. 室温10000 g离心30 s。
s. 弃去Spin Filter。-20 ℃冷冻保存直至PCR扩增。
3. 实时荧光定量PCR扩增
设计该操作流程/步骤是为使用Cepheid的SmartCycler分析猪源肝素样品中反刍动物DNA的存在。在其他操作平台上使用该步骤需要适当的加以调整以验证这部分是否符合（相对应平台的）标准程序。
3.1.实时检测的准备工作
a. 从冰箱中取出装有Sample-Ready Beads的可重复用密封袋。从密封区域顶部的缺口撕开袋子。
b. 从袋中取出所需数量的离心管，并小心开每个离心管。
c. 向每管中加入25 μL无核酸水（无核酸污染的水），用枪头混合后盖上管盖。
d. 使用微量离心机将所有管子快速离心5s。
e. 在检测每一批待测样品的同时，必须设置珠子空白对照（珠子+无DNA的水）分析。
3.2. 步骤
a. 移取25 μL先前准备好的预混液（珠子和水）至SmartCycler PCR反应管。
b. 向每一根对应的PCR反应管中加入1 μL样品。
c. 盖上管盖，在SmartCycler离心机中离心5 s。
d. 将PCR反应管放入SmartCycler区块的每一孔中并盖上各个盖子。
e. 准备运行程序：
f. 点击“Create Run”图标。染料设置选择FCTC。
g. 选择扩增条件（见3.3部分）。
h. 选择适当数量的位点（即在运行的PCR管的数量）
i. 给每一个位点标注一个与每管组分相对应的样品ID。
j. 点击“Start Run”。
注：阳性结果需要有一个循环阈值（Ct值）。
3.3 PCR反应条件
这一操作规程必须在PCR运行开始前加以设定。使用唯一的名称保存参数。
PCR程序：
第一阶段：95.0 ℃120 s（光学元件关闭）
第二阶段：45个循环
95.0 ℃10 s（光学元件关闭）
56.0 ℃60 s（光学元件开启）
注：分析时，Ct值应设定成缺省值30
4. 结果分析
FCTC染料设定用于荧光检测。反刍动物DNA的阳性结果的判定是一个样品在45个反应循环之前于FAM通道出现Ct值。猪的材料的阳性结果是在TxR通道出现阳性的Ct值。扩增内标（IAC）在Cy5通道中报告，有助于降低假阴性报告。许多不同类型肝素样品含有抑制剂。本试验包括一个IAC，以确保PCR的条件是合适的，这样，最大限度地减少由热启动酶的抑制造成的假阴性结果报告。具体地讲，IAC可以反映样品中存在PCR抑制因子时报道的阴性结果。引物与探针能结合反应混合物中合成的序列。
当样品中没有PCR抑制因子，而靶目标没有扩增时，IAC应当产生Ct值为32-37之间的信号。如果目标样品是以浓度存在，IAC可能会也可能不会报告由于竞争而出现的扩增。这是正常的。
如果IAC在Ct值37处仍未出现，或者在目的扩增中没有报告（其Ct值），样品可能含有阻止目的检测的PCR抑制剂。如果观察到这一结果，建议将分装的新的肝素粗品重提并额外纯化后使用。
对于反刍动物样品的阳性结果，应当用PCR对同一DNA样品额外检测两次，即全部三次检测结果均为阳性的，则确认该样品为阳性。
结论
该文介绍了一种使用快速多重实时PCR分析检测猪源粗品肝素中反刍动物原料的方法。hMRTA的评估包括特异性、灵敏度和选择性的评定。一个外部实验室通过盲测方式成功地进行了一次额外的hMRTA实验，作为同行评议。hMRTA不仅成功通过外部同行评议，也通过了内部评估。hMRTA能准确地检测到粗品猪肝素中0.5%（wt/wt）的反刍动物（牛、绵羊和山羊）原料，并验证该粗品肝素的猪源性。
