RT-PCR

数据分析excel地址http://d.dxy.cn/detail/4503890△△Ct法的推导过程PCR指数扩增公式是：Xn = X0 * ( 1 + Ex )n 式中，Xn是第 n 个循环后目标分子数，Xo 是初始目标分子数，Ex是目标分子扩增效率，n 是循环数。用Ct 代表目标扩增产物达到设定阈值所经历的循环数，因此：Xt = X0 * ( 1 + Ex )Ctx 式中，Xt 是目标分子X达到设定的阈值时的分子数，是一个常数。Ctx 是目标分子X扩增达到阈值时（即达到规定的拷贝数时）的循环数。对于看家基因的P ...

这里，很多经常遇到的问题，比如引物设计，PCR体系和条件，电泳条带分析等，我没有一一详细列举，因为这些原因比较容易找到，我这里列举的可能多是些容易忽略的疑难杂症，希望对大家有帮助。（说了是疑难杂症了，可能有一些看法走极端了，但是为了做出实验，怀疑一切，狗急跳墙，没事找抽也是值得的）。1.引物设计引物的参数合理控制，像发卡结构，错配，二聚体等，只要别太过分，问题应该不大，当然没有最好，个人感觉上下游两条引物的退火温度这个参 ...

Panomics公司的QuantiGene2.0 产品是基于Branched DNA（b-DNA）技术，完成核酸水平的精确定量检测。它克服了传统的real-time PCR（或者q-PCR）技术中的种种不确定因素，无需抽提纯化RNA，无需反转录，无需PCR扩增，对样本量下限无要求（只需mRNA拷贝数在检测范围内），只需将样本用特定裂解液裂解后，经探针杂交与信号放大即可迅速得到比real-time PCR更加精确的定量结果。除细胞、组织 ...

我做大鼠心肌的醛固酮合酶RT－PCR，都2个月了，一点结果都没有，偶尔出一条带还不是我所需要的条带，最近有人看了我的基因序列发现局部GC 含量高，建议用la Taq,就又花了300多元反复作了多次还是没有结果，用脑及肾上腺的cDNA作阳性对照也同样，而用同样的cDNA能扩出其他4对目的基因。真郁闷啊，快过年了，老板说节前做不出来节后先上班，业余时间作试验，一定要做出来。看来春节过不好了！那位高手能指点迷津,在下多谢了。我的 ...

请高手帮忙设计一对引物用于RT-PCR,有原基因全序列，我查了国外国内的文献上的引物，经PrimerPrimer5.0验证发现都不太好，自己又从来没有设计过引物序列，故恳请各位有经验的高手帮忙设计一下，多谢！！基因序列如下：ORIGIN1 gggggggggg atttagagac ttgctcttgc actaccaaag ccacaaagca gccttgcaga61 aaagagagct ccatcatgcc tggctcagca ctgc ...

做RT-PCR可能遇到的一些问题，自己对症下药吧问 题1.RT-PCR 灵敏度：在琼脂糖凝胶分析中看到少量或没有RT-PCR产物可能原因：1） RNA被降解建议：使用前在变性胶上分析RNA以验证完整性使用良好的无污染技术分离RNA在将组织从动物体取出后立刻处理在100%甲酰胺中储存RNA2）RNA中包含逆转录抑制剂建议：通过乙醇沉淀RNA除去抑制剂。用70% (v/v) 乙醇对RNA沉淀进行清洗。可以加入糖元 (0.25μg到0.4μg /μl) ...

刚开始作RT-PCR,让同学帮我设计了三个基因的上下游引物，如下： Primer A (bp233C): 5'-GAATTCACCACACGGCCATTGAAGCA-3'Primer B (bp25): 5'-AAGCTTCACATGGACGAGGAGGAGAC-3'Primer Balance: -A- -B- CommentLength 26 26% GC 50 53 3 % differenceTm(癈) 78 71 7 C?differenceTm (2nd round) 84 80 4 C?differencePrimer Ca ...

一：25UL 体系的量如下：无RNA酶水 ？undefinedbuffer 5.0ULDNTP Mix 1.0ULEnzyme Mix 1.0ULprimer A ?(0.6M)Primer B ?(0.6M)RNA模板 ？（不大于1UL）Q (RNA酶抑制剂） 可加可不加二：虽说有几个试剂未知其量，但都是需要算的，给据要求，引物及RNA模板都可计算,具体如下：1. 引物量的计算：跟据引物说明书稀释引物，例如：primer A 1OD 48UL 意思实说：1OD （一般公司给合成的为每管1OD,量为100M）引物加4 ...

【产品研发背景】埃博拉病毒Ebola virus（EBOV），属于丝状病毒科丝状病毒属成员，是非分节段的单股负链RNA病毒。埃博拉病毒是一种高度危险的病原体，具有发病率快，致死率高的特点。目前已鉴定的埃博拉病毒有5 种亚型，分别是：EBOV-扎伊尔型（Ebola-Zaire，简称EBOV-Z），EBOV-苏丹型（Ebola-Sudan 简称EBOV-S），EBOV-本迪布焦型（Ebola-Bundibugyo，简称EBOV-B），EBOV- ...

一、　　　原理　　硕盟TRIzol是一种快捷方便的总RNA提取试剂，可以从动物组织、各种微生物及细胞等中提取总RNA。在样品处理过程中，TRIzol可完全充分裂解样品，同时保持RNA的完整性。加入氯仿离心后，溶液形成上清层（水相）、中间层和有机相（下层）。取出上清层，可用异丙醇沉淀回收RNA；中间层用乙醇沉淀回收DNA；有机相可用异丙醇沉淀回收蛋白。　　　硕盟TRIzol试剂可用于少量样品的RNA提取，也可用于大量样品的RNA提取。提取R ...

我要检测一个受体蛋白，提取的脑组织，Trizol提取组织RNA，加异丙醇离心后能见到明显的沉淀，按照TakaRa 的RNA LA PCR KIT(AMV) VER.1.1说明书操作，在逆转录后PCR不再加dNTP。逆转录后PCR用actin引物能模糊扩出一些东西，但有两条以上的带(第二次都快扩成100bpMARKER了！）。目的片段干干净净什么都没有！目的片断的引物一个是外国文献上的，一个 是自己设计的，都没有扩出来。小弟还菜，想大家给点建 ...

Protocol for competitive RT-PCRFor quantifying mRNA, we use a competitive RT-PCR protocol with internal standard RNAs. These are added in a defined quantity to the RNA sample prior to the RT reaction. The resulting standard cDNA is coamplified with the same primers as the endogenous target seq ...

Reverse Tranase-PCRThis method was submitted by Jim Hutchins from the University of Mississippi Medical Center.The following is a great RT-PCR protocol developed by Ignacio Rodriguez at the National Eye Institue, NIH.ReferencesRaineri, I., Moroni, C. and Senn, H.P. (1991).Improved e ...

刚刚接触RT-PCR实验,现在遇到一些问题.特向各位高人请教.我做的是关于大鼠erg,mink,KvLQT的基因表达,引物是老板按照文献给的,源自于Circulation(2000;101:2007-2014),作者是日本人.非常困惑的是没有GENEBANK的NO,对于这些引物我非常想核对,但是无从谈起.硬着头皮做了,可是发现跑出的条带不对头,与Marker比较都大了许多,erg大约是900左右,这是不是就是所谓的基因 ...

各位大侠，我想用RTPCR方法来做水稻HSP70基因的表达，但是水稻的HSP70很多不知道选哪个好，就选了这个，另外我用这个基因的CDNA做了BLAST后发现其500BP和1900bp之间和其它的HSP70基因是相同的，我想设计个500BP和1900bp之间的引物就可以把所有的HSP70基因的表达鉴定出来了，是这样吗但是不知道如何来选择设计引物，哪位帮忙来设计一下AK065431. Oryza sativa (jap. ...

我依据所查的资料，用primer.0设计了以下引物，上游：TGGGACACTGATGAGGGATA 下游：GGCACAAGGCAGACAAAT其中下游链存在错配，这是否会影响扩增结果。麻烦各位看看整体设计否合理？？附：D63902. Reports Mus musculus mRNA... LinksLOCUS MUSEFP 5475 bp mRNA linear ROD 29-MAY-2002DEFINITION Mus musculus mRNA for estrogen-res ...

一提RT-PCR，我便黯然泪下。我参考了一篇外文，用了他的引物，并且这个引物在PRIMER5.0也验证了存在。做了三个月了，却总有非特异性条带，而且比目的条带还要亮。调了很多条件，什么退火温度，镁离子，用OLIGODT，随机引物，下游引物，AMV，MMLV反转录，加DMSO，都不行。做了对照，应该没有污染。发信过去问了原作者，他说他做的没问题。可我偏偏做无法达到只有特异性条带，终于下定决心去测序，结果更是给我一重重的打击。 ...

我搜集了几个植物RT-PCR的内标,与各位共享1． 物种：拟南芥（arabidopsis）或maize2． 基因名称：18S rRNA3． 模板：cDNA4． PCR类型及目的：RT-PCR5． Forward primer (5’-3’): CCATAAACGATGCCGGAReverse primer (5’-3’): CACCACCCATAGAATCAAGAProbe: 无6． 产物长度（bp）：3507． 引物浓度：50 pmol/ul8． 退火温度：54.19． 所用仪器：PE-960010． 提交 ...

以下是我在网上查到的有关RT-PCR的资料,同丁香园的战友共享,希望对这方面实验的战友有所帮助!RT-PCR实验有三步：抽提RNA，RT，PCR。要求：1.做RT前必需测RNA浓度，逆转录体系对RNA量还是有一些要求，常用500ng或1ug。2. RT按要求做，一般不会出太大问题。3. PCR，按常规。但如需扩长片段，则对前两步要求较高，需要有完整的cDNA存在，不是单改变Mg2+浓度、退火温度能解决的。1）RT和PCR时的引物设 ...

请大侠帮忙看一下用下列两引物进行PCR扩增有没有可行性上游引物：5'-GCCAGACTGGGAAGAAATCTG-3’下游引物：5'-TGTGTTGGAAAATCCAAGTCA-3’基因序列：　　1 aggcagtgga gccccggcgg cggcggcggc ggcgcgcggg ggcgacgcgc gggaacaacg61 cgagtcggcg cgcgggacga agaataatca tgggccagac tgggaagaaa tctgagaag ...