【分享】RT-PCR 的常见问题及分析
丁香园论坛
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一、 原理
硕盟TRIzol是一种快捷方便的总RNA提取试剂，可以从动物组织、各种微生物及细胞等中提取总RNA。在样品处理过程中，TRIzol可完全充分裂解样品，同时保持RNA的完整性。加入氯仿离心后，溶液形成上清层（水相）、中间层和有机相（下层）。取出上清层，可用异丙醇沉淀回收RNA；中间层用乙醇沉淀回收DNA；有机相可用异丙醇沉淀回收蛋白。
硕盟TRIzol试剂可用于少量样品的RNA提取，也可用于大量样品的RNA提取。提取RNA 整个过程方便快速，整个操作过程可一个小时内完成，提取的RNA无蛋白和DNA的污染，纯度髙，可直接用于Northern Blotting、斑点杂交、polyA筛选、mRNA纯化、体外翻译、RNase保护分析、RT-PCR、构建cDNA文库等各种分子生物学实验。
二 操作步骤
RNA提取过程的关键是建立一个无RNase的实验环境，因此在整个操作过程中要防止RNase的污染，应注意以下几点：
实验过程中经常更换新手套，使用专用超净台，在操作过程中避免讲话；
应尽量使用无RNase的实验器材；枪头、塑料制品和玻璃制品可以用0.1％DEPC(焦碳酸二乙酯)水溶液在37℃处理过夜，然后在120℃下高压灭菌30min以去除残留的DEPC。玻璃制品也可用干热灭菌去除RNase（180℃烘烤2h）；
配制溶液应使用无RNase水（无RNase水的配制方法：双蒸水加入DEPC至终浓度0.01％ V/V，放置过夜，然后120℃下高压灭菌30min，备用）；
整个实验过程中使用的试剂，实验器材和无RNase水应专用，避免交叉污染。
用户自备试剂：氯仿、异丙醇、75％乙醇（用DEPC处理过的水配制）、无RNase的无菌水。
注： 1.75％乙醇要在-20°冰箱预冷。
2.为提高RNA纯度，加氯仿离心取上清液后，可再加一次氯仿摇匀4°冰箱15分钟，离心（12000g
15分钟）
3.最后75%酒精沉淀后的RNA先用DEPC水洗一两次。然后再加DEPC水溶解。（此部可不做）。
4.另外加氯仿离心取上清液后，可不加氯仿直接同样条件离心几分钟内，也可以提高RNA的纯度。
5.所提取的RNA为乳白色沉淀.
样品处理
A 贴壁培养细胞
① 倒净培养液；
② 每10cm2生长的培养细胞中加入1mL硕盟TRIzol试剂，在室温下水平放置5min，使裂解液均匀分布于细胞表面，然后用移液枪吹打细胞使细胞脱落；
③ 将细胞裂解液转移至离心管中，并用1mL枪头反复吹打直至裂解液中无明显沉淀，在室温下放置5min，使得核酸蛋白复合物完全分离；
B 悬浮培养细胞
① 直接离心收集细胞，倒净培养液；
② 细胞沉淀中每5～10×106细胞加入1mL硕盟TRIzol试剂；
③ 将细胞裂解液转移至离心管中，并用1ml枪头反复吹打直至裂解液中无明显沉淀，在室温下放 置5min，使得核酸蛋白复合物完全分离；
C 动、植物组织材料
① 将组织在液氮中磨碎成粉末状（应无明显颗粒）；
② 每50～100mg的组织加1mL硕盟TRIzol试剂，样品的体积不应超过TRIzol试剂体积的10％，并用匀浆器进行匀浆，直至匀浆液呈无颗粒透明状；
③ 将细胞裂解液转移至离心管中，在室温下放置5min，使得核酸蛋白复合物完全分离；
④ 12,000g， 4℃离心10min，然后小心吸取上清液，移入新的离心管中；
2． 向上述步骤1得到的裂解液中加入氯仿（每使用1mL硕盟TRIzol加0.2mL氯仿），盖紧离心管管盖，用手上下振荡15s（请勿涡漩激烈振荡），得粉红色浑浊液，无分层现象，室温静置3min；
3． 12,000g，4℃离心15min；
4． 取出离心管，样品分为三层：无色的上清水相、中间的白色层及粉红色的下层有机相。小心吸取无色上清水相移至另一离心管，水相的体积约为所用硕盟TRIzol试剂的60％；
5． 向步骤4得到的上清水相加入等体积的异丙醇，轻轻混匀，室温静置10min；
6． 12,000g，4℃离心10min；
7． 小心去除上清，缓慢沿管壁加入1mL75％的乙醇（用DEPC处理过的水配制），轻轻混匀。每使用1mL硕盟TRIzol试剂至少加1mL 75％的乙醇；
8． 12,000g，4℃离心10min；
9． 小心吸尽上清；
10．室温干燥沉淀2～5min（不可晾得太干，否则RNA将会很难溶解），加入30～50μL的无RNase水溶解RNA沉淀，待完全溶解后于-70℃保存。
取RNA样品用1×TE Buffer（见备注）稀释样品100倍或适当的倍数，测定样品在260nm和280 nm的吸收值确定RNA的质量。
也可用DEPC处理水稀释测吸光度.
RNA的浓度＝OD260×稀释倍数×0.04μg/μL，OD260/280 在1.8～2.1视为抽提的RNA的纯度很高。
四、注意事项
本试剂含强变性剂，应避免与皮肤接触，如接触皮肤，应立即用大量的水冲洗，根据需要情况到医院处理。本品含有酚类、巯基乙醇等成分，具有特殊气味，请于吸取试剂溶液后马上盖好瓶盖，或于通风橱中操作。
五、常见问题分析
1． 一般情况下每毫克的组织或1×106个细胞中所能提取的RNA量见下表：
组织材料
TotalRNA提取量
上皮细胞
约10μg
成纤维细胞
约6μg
肝脏
约5μg
肾脏
约3μg
肌肉或脑
约1.5μg
2． 常见问题及解决方案
常见问题
可能原因
建议解决方案
产率低
含有裂解液的样品经匀浆混匀后未在室温静置，或静置的时间不足5分钟
严格按照说明书操作
RNA不完全溶解
缩短晾干时间
三相分离时，吸取上清液不完全
尽量回收上清液
A260/A280＜1.65
测定OD值时用的是水溶液
更换测定OD值时的溶液，用TE Buffer
TRIzol加量太少，造成蛋白质变性不充分
严格按照说明书操作
含有裂解液的样品经匀浆混匀后未在室温静置，或静置的时间不足5分钟
严格按照说明书操作
RNA不完全溶解
缩短晾干时间
三相分离后，吸取上清液时不小心接触蛋白层造成污染
小心吸取上清
RNA降解
使用的组织材料不够新鲜
提取RNA的组织材料应采用新鲜的组织材料，或将新鲜的组织材料用液氮迅速冷冻后置于-80℃保存
细胞用胰酶消化
不要用胰酶消化细胞
提取RNA时使用的试剂及器材中有RNase污染
做好试验前的准备工作，保证无RNase污染
提取的组织材料中含有大量的RNase
加大TRIzol的用量
DNA污染
裂解组织或细胞使用的TRIzol量偏少
加大TRIzol的用量
使用的组织材料中含有大量的有机溶剂（如：乙醇、异丙醇等)、高浓度的Buffer、碱性溶剂等
用DEPC 水充分洗涤组织
多糖的污染
多糖的理化学性质与RNA十分接近，因此很难将其从RNA中除去
加大TRIzol的用量
六、储存
避光4℃保存
保存期：一年
七、备注
1×TE Buffer（1L） 配制方法：
1.21gTris(10mM)，0.372gEDTA (1mM)， HCl调pH 至7.4。
硕盟TRIzol是一种快捷方便的总RNA提取试剂，可以从动物组织、各种微生物及细胞等中提取总RNA。在样品处理过程中，TRIzol可完全充分裂解样品，同时保持RNA的完整性。加入氯仿离心后，溶液形成上清层（水相）、中间层和有机相（下层）。取出上清层，可用异丙醇沉淀回收RNA；中间层用乙醇沉淀回收DNA；有机相可用异丙醇沉淀回收蛋白。
硕盟TRIzol试剂可用于少量样品的RNA提取，也可用于大量样品的RNA提取。提取RNA 整个过程方便快速，整个操作过程可一个小时内完成，提取的RNA无蛋白和DNA的污染，纯度髙，可直接用于Northern Blotting、斑点杂交、polyA筛选、mRNA纯化、体外翻译、RNase保护分析、RT-PCR、构建cDNA文库等各种分子生物学实验。
二 操作步骤
RNA提取过程的关键是建立一个无RNase的实验环境，因此在整个操作过程中要防止RNase的污染，应注意以下几点：
实验过程中经常更换新手套，使用专用超净台，在操作过程中避免讲话；
应尽量使用无RNase的实验器材；枪头、塑料制品和玻璃制品可以用0.1％DEPC(焦碳酸二乙酯)水溶液在37℃处理过夜，然后在120℃下高压灭菌30min以去除残留的DEPC。玻璃制品也可用干热灭菌去除RNase（180℃烘烤2h）；
配制溶液应使用无RNase水（无RNase水的配制方法：双蒸水加入DEPC至终浓度0.01％ V/V，放置过夜，然后120℃下高压灭菌30min，备用）；
整个实验过程中使用的试剂，实验器材和无RNase水应专用，避免交叉污染。
用户自备试剂：氯仿、异丙醇、75％乙醇（用DEPC处理过的水配制）、无RNase的无菌水。
注： 1.75％乙醇要在-20°冰箱预冷。
2.为提高RNA纯度，加氯仿离心取上清液后，可再加一次氯仿摇匀4°冰箱15分钟，离心（12000g
15分钟）
3.最后75%酒精沉淀后的RNA先用DEPC水洗一两次。然后再加DEPC水溶解。（此部可不做）。
4.另外加氯仿离心取上清液后，可不加氯仿直接同样条件离心几分钟内，也可以提高RNA的纯度。
5.所提取的RNA为乳白色沉淀.
样品处理
A 贴壁培养细胞
① 倒净培养液；
② 每10cm2生长的培养细胞中加入1mL硕盟TRIzol试剂，在室温下水平放置5min，使裂解液均匀分布于细胞表面，然后用移液枪吹打细胞使细胞脱落；
③ 将细胞裂解液转移至离心管中，并用1mL枪头反复吹打直至裂解液中无明显沉淀，在室温下放置5min，使得核酸蛋白复合物完全分离；
B 悬浮培养细胞
① 直接离心收集细胞，倒净培养液；
② 细胞沉淀中每5～10×106细胞加入1mL硕盟TRIzol试剂；
③ 将细胞裂解液转移至离心管中，并用1ml枪头反复吹打直至裂解液中无明显沉淀，在室温下放 置5min，使得核酸蛋白复合物完全分离；
C 动、植物组织材料
① 将组织在液氮中磨碎成粉末状（应无明显颗粒）；
② 每50～100mg的组织加1mL硕盟TRIzol试剂，样品的体积不应超过TRIzol试剂体积的10％，并用匀浆器进行匀浆，直至匀浆液呈无颗粒透明状；
③ 将细胞裂解液转移至离心管中，在室温下放置5min，使得核酸蛋白复合物完全分离；
④ 12,000g， 4℃离心10min，然后小心吸取上清液，移入新的离心管中；
2． 向上述步骤1得到的裂解液中加入氯仿（每使用1mL硕盟TRIzol加0.2mL氯仿），盖紧离心管管盖，用手上下振荡15s（请勿涡漩激烈振荡），得粉红色浑浊液，无分层现象，室温静置3min；
3． 12,000g，4℃离心15min；
4． 取出离心管，样品分为三层：无色的上清水相、中间的白色层及粉红色的下层有机相。小心吸取无色上清水相移至另一离心管，水相的体积约为所用硕盟TRIzol试剂的60％；
5． 向步骤4得到的上清水相加入等体积的异丙醇，轻轻混匀，室温静置10min；
6． 12,000g，4℃离心10min；
7． 小心去除上清，缓慢沿管壁加入1mL75％的乙醇（用DEPC处理过的水配制），轻轻混匀。每使用1mL硕盟TRIzol试剂至少加1mL 75％的乙醇；
8． 12,000g，4℃离心10min；
9． 小心吸尽上清；
10．室温干燥沉淀2～5min（不可晾得太干，否则RNA将会很难溶解），加入30～50μL的无RNase水溶解RNA沉淀，待完全溶解后于-70℃保存。
取RNA样品用1×TE Buffer（见备注）稀释样品100倍或适当的倍数，测定样品在260nm和280 nm的吸收值确定RNA的质量。
也可用DEPC处理水稀释测吸光度.
RNA的浓度＝OD260×稀释倍数×0.04μg/μL，OD260/280 在1.8～2.1视为抽提的RNA的纯度很高。
四、注意事项
本试剂含强变性剂，应避免与皮肤接触，如接触皮肤，应立即用大量的水冲洗，根据需要情况到医院处理。本品含有酚类、巯基乙醇等成分，具有特殊气味，请于吸取试剂溶液后马上盖好瓶盖，或于通风橱中操作。
五、常见问题分析
1． 一般情况下每毫克的组织或1×106个细胞中所能提取的RNA量见下表：
组织材料
TotalRNA提取量
上皮细胞
约10μg
成纤维细胞
约6μg
肝脏
约5μg
肾脏
约3μg
肌肉或脑
约1.5μg
2． 常见问题及解决方案
常见问题
可能原因
建议解决方案
产率低
含有裂解液的样品经匀浆混匀后未在室温静置，或静置的时间不足5分钟
严格按照说明书操作
RNA不完全溶解
缩短晾干时间
三相分离时，吸取上清液不完全
尽量回收上清液
A260/A280＜1.65
测定OD值时用的是水溶液
更换测定OD值时的溶液，用TE Buffer
TRIzol加量太少，造成蛋白质变性不充分
严格按照说明书操作
含有裂解液的样品经匀浆混匀后未在室温静置，或静置的时间不足5分钟
严格按照说明书操作
RNA不完全溶解
缩短晾干时间
三相分离后，吸取上清液时不小心接触蛋白层造成污染
小心吸取上清
RNA降解
使用的组织材料不够新鲜
提取RNA的组织材料应采用新鲜的组织材料，或将新鲜的组织材料用液氮迅速冷冻后置于-80℃保存
细胞用胰酶消化
不要用胰酶消化细胞
提取RNA时使用的试剂及器材中有RNase污染
做好试验前的准备工作，保证无RNase污染
提取的组织材料中含有大量的RNase
加大TRIzol的用量
DNA污染
裂解组织或细胞使用的TRIzol量偏少
加大TRIzol的用量
使用的组织材料中含有大量的有机溶剂（如：乙醇、异丙醇等)、高浓度的Buffer、碱性溶剂等
用DEPC 水充分洗涤组织
多糖的污染
多糖的理化学性质与RNA十分接近，因此很难将其从RNA中除去
加大TRIzol的用量
六、储存
避光4℃保存
保存期：一年
七、备注
1×TE Buffer（1L） 配制方法：
1.21gTris(10mM)，0.372gEDTA (1mM)， HCl调pH 至7.4。
