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        【共享】RT-PCR疑难解答

        丁香园论坛

        1546
        做RT-PCR可能遇到的一些问题,自己对症下药吧
        问 题1.
        RT-PCR 灵敏度:在琼脂糖凝胶分析中看到少量或没有RT-PCR产物  
        可能原因:
        1) RNA被降解
        建议:
        使用前在变性胶上分析RNA以验证完整性
        使用良好的无污染技术分离RNA
        在将组织从动物体取出后立刻处理
        在100%甲酰胺中储存RNA
        2)RNA中包含逆转录抑制剂
        建议:
        通过乙醇沉淀RNA除去抑制剂。用70% (v/v) 乙醇对RNA沉淀进行清洗。可以加入糖元 (0.25μg到0.4μg /μl) 以帮助小量样品RNA的恢复。
        逆转录抑制剂包括:SDS, EDTA, 甘油,焦磷酸钠,亚精胺,甲酰胺和胍盐。
        将对照RNA同样品混合,同对照RNA反应比较产量以检验抑制剂。
        3)多糖同RNA共沉淀
        使用氯化锂沉淀RNA以除去多糖。
        4)用于合成cDNA第一链合成的引物没有很好退火
        建议:
        确定退火温度适合您的引物。对于随机六聚体,建议在反应温度保温之前先在25℃保温10分钟。
        对于基因特异性引物 (GSP),可以试一下其他GSP,或换用oligo(dT) 或随机六聚体,确定GSP是反义序列。
        5)起始RNA量不够
        建议:
        增加RNA量。
        对于<50 ng的RNA样品,可以在第一链cDNA合成中使用0.1μg到0.5μg乙酰BSA。
        6)RNA模板二级结构太多
        建议:
        将RNA和引物在不含盐及缓冲液条件下变性/退火
        提高逆转录反应温度,对SuperScriptⅡ可以到50℃,对ThermoScript可以到65℃。
        注意:不要在>60℃时使用oligo(dT)引物,选择一个在反应温度可以退火 的GSP。对于>1 kb的RT-PCR产物,保持反应温度≤65℃。
        注意:不要在高于37℃时使用M-MLV。
        如果不需要全长cDNA,在第一链反应中使用随机引物。
        7)引物或模板对残余的RNA模板敏感
        建议:在PCR前用RNaseH处理。
        8)靶序列在分析的组织中不表达
        建议:尝试其他靶序列或组织。
        9)PCR没有起作用
        建议: 对两步法RT-PCR,不要在PCR步骤中使用超过1/5的逆转录反应产物。

        问题2
        RT-PCR时在琼脂糖凝胶分析中观察到非预期条带
        1)引物和模板非特异性退火
        在第一链合成中使用GSP,而不是随机引物或oligo (dT)。
        试用允许高温cDNA合成的GSP。
        2)GSP设计较差
        遵循用于扩增引物设计的同样原则。
        3)RNA中沾染了基因组DNA
        使用扩增级DNaseⅠ处理RNA。使用没有逆转录的对照反应检测DNA污染。

        问题3
        定量RT-PCR无扩增产物,相对荧光信号≤背景或没有模板对照
        可能原因:
        1)无cDNA合成
        2)cDNA合成温度太高,低引物效率。降低保温温度
        3)反转录或cDNA产物被二级结构封闭。提高保温温度。重新设计引物
        4)RNA被损害或降解。更换RNA
        5)RNAse污染。维持无菌条件;加入RNase抑制剂。
        6)荧光探针无功能。
        确保探针设计的有效性和fluorophore 和quencher的存在。
        用DNase处理TaqMan探针,检验荧光是否增强。
        必要的话重新设计或合成探针。

        问题4
        灵敏度低,须在比预期更高的循环中检出产物
        1)初始模板RNA不充分。
        增加模板RNA的浓度;使用10ng-1μg的总RNA
        2)RNA被损害或降解。
        必要的话更换RNA
        3)RNAse污染。
        维持无菌条件;加入RNase抑制剂
        4)无效的cDNA合成。
        通过增加70%乙醇清洗的次数来去除制备RNA过程中的抑制剂
        5)无效的PCR扩增。
        调整cDNA合成温度或引物设计。反转录的抑制剂包括SDS,EDTA,胍盐,甲酰胺,磷酸钠和亚精胺。

        问题5
        信号高于预期,在低于预期的循环中即可检出产物
        1)反应中加的样品太多。
        减低模板的浓度
        2模板或PCR残余污染。
        隔离污染来源,更换试剂
        使用专用的精致移液器。在无DNA区域准备反应,使用抗气溶胶的吸头。

        问题6
        电泳后出现意外的条带

        1)RNA被基因组DNA污染。
        用DNase I预处理RNA
        2)用于第一链合成的寡聚dT或随机引物。
        使用基因特异性引物
        3)PCR的低特异性。
        优化PCR条件
        4)形成引物二聚体
        设计在3'端没有互补序列的引物。
        5)引物和模板非特异性退火
        以2℃到5℃间隔增加退火温度,减少退火时间。
        在开始几个循环使用较高的退火温度,然后使用较低的退火温度。
        使用Taq DNA进行自动热启动PCR。
        避免在引物3'端含有2到3个dG或dC。
        6)镁离子浓度太高
        对于每一个模板和引物组合优化镁离子浓度。
        7)因为扩增复杂模板导致引物错误起始
        使用巢式PCR或递减PCR。
        8)沾染外源DNA
        使用抗气雾剂的吸头和UDG。
        9)因为二级结构导致引物结合位点无法接近
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