【共享】RT-PCR疑难解答
丁香园论坛
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做RT-PCR可能遇到的一些问题，自己对症下药吧
问 题1.
RT-PCR 灵敏度：在琼脂糖凝胶分析中看到少量或没有RT-PCR产物
可能原因：
1） RNA被降解
建议：
使用前在变性胶上分析RNA以验证完整性
使用良好的无污染技术分离RNA
在将组织从动物体取出后立刻处理
在100%甲酰胺中储存RNA
2）RNA中包含逆转录抑制剂
建议：
通过乙醇沉淀RNA除去抑制剂。用70% (v/v) 乙醇对RNA沉淀进行清洗。可以加入糖元 (0.25μg到0.4μg /μl) 以帮助小量样品RNA的恢复。
逆转录抑制剂包括：SDS, EDTA, 甘油，焦磷酸钠，亚精胺，甲酰胺和胍盐。
将对照RNA同样品混合，同对照RNA反应比较产量以检验抑制剂。
3）多糖同RNA共沉淀
使用氯化锂沉淀RNA以除去多糖。
4）用于合成cDNA第一链合成的引物没有很好退火
建议：
确定退火温度适合您的引物。对于随机六聚体，建议在反应温度保温之前先在25℃保温10分钟。
对于基因特异性引物 (GSP)，可以试一下其他GSP，或换用oligo(dT) 或随机六聚体，确定GSP是反义序列。
5）起始RNA量不够
建议：
增加RNA量。
对于＜50 ng的RNA样品，可以在第一链cDNA合成中使用0.1μg到0.5μg乙酰BSA。
6）RNA模板二级结构太多
建议：
将RNA和引物在不含盐及缓冲液条件下变性/退火
提高逆转录反应温度，对SuperScriptⅡ可以到50℃，对ThermoScript可以到65℃。
注意：不要在＞60℃时使用oligo(dT)引物，选择一个在反应温度可以退火 的GSP。对于＞1 kb的RT-PCR产物，保持反应温度≤65℃。
注意：不要在高于37℃时使用M-MLV。
如果不需要全长cDNA，在第一链反应中使用随机引物。
7）引物或模板对残余的RNA模板敏感
建议：在PCR前用RNaseH处理。
8）靶序列在分析的组织中不表达
建议：尝试其他靶序列或组织。
9）PCR没有起作用
建议： 对两步法RT-PCR，不要在PCR步骤中使用超过1/5的逆转录反应产物。
问题2
RT-PCR时在琼脂糖凝胶分析中观察到非预期条带
1）引物和模板非特异性退火
在第一链合成中使用GSP，而不是随机引物或oligo (dT)。
试用允许高温cDNA合成的GSP。
2）GSP设计较差
遵循用于扩增引物设计的同样原则。
3）RNA中沾染了基因组DNA
使用扩增级DNaseⅠ处理RNA。使用没有逆转录的对照反应检测DNA污染。
问题3
定量RT-PCR无扩增产物，相对荧光信号≤背景或没有模板对照
可能原因：
1）无cDNA合成
2）cDNA合成温度太高，低引物效率。降低保温温度
3）反转录或cDNA产物被二级结构封闭。提高保温温度。重新设计引物
4）RNA被损害或降解。更换RNA
5）RNAse污染。维持无菌条件；加入RNase抑制剂。
6）荧光探针无功能。
确保探针设计的有效性和fluorophore 和quencher的存在。
用DNase处理TaqMan探针，检验荧光是否增强。
必要的话重新设计或合成探针。
问题4
灵敏度低，须在比预期更高的循环中检出产物
1）初始模板RNA不充分。
增加模板RNA的浓度；使用10ng-1μg的总RNA
2)RNA被损害或降解。
必要的话更换RNA
3)RNAse污染。
维持无菌条件；加入RNase抑制剂
4)无效的cDNA合成。
通过增加70%乙醇清洗的次数来去除制备RNA过程中的抑制剂
5)无效的PCR扩增。
调整cDNA合成温度或引物设计。反转录的抑制剂包括SDS，EDTA，胍盐，甲酰胺，磷酸钠和亚精胺。
问题5
信号高于预期，在低于预期的循环中即可检出产物
1）反应中加的样品太多。
减低模板的浓度
2模板或PCR残余污染。
隔离污染来源，更换试剂
使用专用的精致移液器。在无DNA区域准备反应，使用抗气溶胶的吸头。
问题6
电泳后出现意外的条带
1）RNA被基因组DNA污染。
用DNase I预处理RNA
2）用于第一链合成的寡聚dT或随机引物。
使用基因特异性引物
3）PCR的低特异性。
优化PCR条件
4）形成引物二聚体
设计在3'端没有互补序列的引物。
5）引物和模板非特异性退火
以2℃到5℃间隔增加退火温度，减少退火时间。
在开始几个循环使用较高的退火温度，然后使用较低的退火温度。
使用Taq DNA进行自动热启动PCR。
避免在引物3'端含有2到3个dG或dC。
6）镁离子浓度太高
对于每一个模板和引物组合优化镁离子浓度。
7）因为扩增复杂模板导致引物错误起始
使用巢式PCR或递减PCR。
8）沾染外源DNA
使用抗气雾剂的吸头和UDG。
9）因为二级结构导致引物结合位点无法接近
问 题1.
RT-PCR 灵敏度：在琼脂糖凝胶分析中看到少量或没有RT-PCR产物
可能原因：
1） RNA被降解
建议：
使用前在变性胶上分析RNA以验证完整性
使用良好的无污染技术分离RNA
在将组织从动物体取出后立刻处理
在100%甲酰胺中储存RNA
2）RNA中包含逆转录抑制剂
建议：
通过乙醇沉淀RNA除去抑制剂。用70% (v/v) 乙醇对RNA沉淀进行清洗。可以加入糖元 (0.25μg到0.4μg /μl) 以帮助小量样品RNA的恢复。
逆转录抑制剂包括：SDS, EDTA, 甘油，焦磷酸钠，亚精胺，甲酰胺和胍盐。
将对照RNA同样品混合，同对照RNA反应比较产量以检验抑制剂。
3）多糖同RNA共沉淀
使用氯化锂沉淀RNA以除去多糖。
4）用于合成cDNA第一链合成的引物没有很好退火
建议：
确定退火温度适合您的引物。对于随机六聚体，建议在反应温度保温之前先在25℃保温10分钟。
对于基因特异性引物 (GSP)，可以试一下其他GSP，或换用oligo(dT) 或随机六聚体，确定GSP是反义序列。
5）起始RNA量不够
建议：
增加RNA量。
对于＜50 ng的RNA样品，可以在第一链cDNA合成中使用0.1μg到0.5μg乙酰BSA。
6）RNA模板二级结构太多
建议：
将RNA和引物在不含盐及缓冲液条件下变性/退火
提高逆转录反应温度，对SuperScriptⅡ可以到50℃，对ThermoScript可以到65℃。
注意：不要在＞60℃时使用oligo(dT)引物，选择一个在反应温度可以退火 的GSP。对于＞1 kb的RT-PCR产物，保持反应温度≤65℃。
注意：不要在高于37℃时使用M-MLV。
如果不需要全长cDNA，在第一链反应中使用随机引物。
7）引物或模板对残余的RNA模板敏感
建议：在PCR前用RNaseH处理。
8）靶序列在分析的组织中不表达
建议：尝试其他靶序列或组织。
9）PCR没有起作用
建议： 对两步法RT-PCR，不要在PCR步骤中使用超过1/5的逆转录反应产物。
问题2
RT-PCR时在琼脂糖凝胶分析中观察到非预期条带
1）引物和模板非特异性退火
在第一链合成中使用GSP，而不是随机引物或oligo (dT)。
试用允许高温cDNA合成的GSP。
2）GSP设计较差
遵循用于扩增引物设计的同样原则。
3）RNA中沾染了基因组DNA
使用扩增级DNaseⅠ处理RNA。使用没有逆转录的对照反应检测DNA污染。
问题3
定量RT-PCR无扩增产物，相对荧光信号≤背景或没有模板对照
可能原因：
1）无cDNA合成
2）cDNA合成温度太高，低引物效率。降低保温温度
3）反转录或cDNA产物被二级结构封闭。提高保温温度。重新设计引物
4）RNA被损害或降解。更换RNA
5）RNAse污染。维持无菌条件；加入RNase抑制剂。
6）荧光探针无功能。
确保探针设计的有效性和fluorophore 和quencher的存在。
用DNase处理TaqMan探针，检验荧光是否增强。
必要的话重新设计或合成探针。
问题4
灵敏度低，须在比预期更高的循环中检出产物
1）初始模板RNA不充分。
增加模板RNA的浓度；使用10ng-1μg的总RNA
2)RNA被损害或降解。
必要的话更换RNA
3)RNAse污染。
维持无菌条件；加入RNase抑制剂
4)无效的cDNA合成。
通过增加70%乙醇清洗的次数来去除制备RNA过程中的抑制剂
5)无效的PCR扩增。
调整cDNA合成温度或引物设计。反转录的抑制剂包括SDS，EDTA，胍盐，甲酰胺，磷酸钠和亚精胺。
问题5
信号高于预期，在低于预期的循环中即可检出产物
1）反应中加的样品太多。
减低模板的浓度
2模板或PCR残余污染。
隔离污染来源，更换试剂
使用专用的精致移液器。在无DNA区域准备反应，使用抗气溶胶的吸头。
问题6
电泳后出现意外的条带
1）RNA被基因组DNA污染。
用DNase I预处理RNA
2）用于第一链合成的寡聚dT或随机引物。
使用基因特异性引物
3）PCR的低特异性。
优化PCR条件
4）形成引物二聚体
设计在3'端没有互补序列的引物。
5）引物和模板非特异性退火
以2℃到5℃间隔增加退火温度，减少退火时间。
在开始几个循环使用较高的退火温度，然后使用较低的退火温度。
使用Taq DNA进行自动热启动PCR。
避免在引物3'端含有2到3个dG或dC。
6）镁离子浓度太高
对于每一个模板和引物组合优化镁离子浓度。
7）因为扩增复杂模板导致引物错误起始
使用巢式PCR或递减PCR。
8）沾染外源DNA
使用抗气雾剂的吸头和UDG。
9）因为二级结构导致引物结合位点无法接近
