【分享】RT-PCR的反应体系
丁香园论坛
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一：25UL 体系的量如下：
无RNA酶水 ？
undefinedbuffer 5.0UL
DNTP Mix 1.0UL
Enzyme Mix 1.0UL
primer A ?(0.6M)
Primer B ?(0.6M)
RNA模板 ？（不大于1UL）
Q (RNA酶抑制剂） 可加可不加
二：虽说有几个试剂未知其量，但都是需要算的，给据要求，引物及RNA模板都可计算,具体如下：
1. 引物量的计算：
跟据引物说明书稀释引物，例如：
primer A 1OD 48UL 意思实说：1OD （一般公司给合成的为每管1OD,量为100M）引物加48UL 0.1%DEPC处理12小时以上并高压过的水，混匀，即为母液；然后取10UL于另一EP管中，加30UL0.1%DEPC处理12小时以上并高压过的水，用移液器吹打混匀，即为工作液。注明稀释日期及性质，-20度冰箱备用。
所需引物量为=(0.6undefined40Uundefined48UL)/(100undefined10UL)
同理 Primer B的计算相同 。
2.RNA模板的计算：
一般25UL反应体系中，需500ng或1ug的量，如按照1ug计算：
（1）总RNA浓度一定要知道:可通过测吸光度来计算，1OD=40ug，公式如下：
总RNA浓度=OD值40uundefined稀释倍数/1000 (ug/uL)
（2）所需RNA模板量为=1/总RNA浓度 (uL)
这样水的量就自然定了。
三：具体步骤
（1）先将所用的试剂放于冰盒上
（2）把除引物外的其它试剂都加好，用移液器混匀
（3）再加模板RNA并混匀
（4）将EP管放于已预热的PCR仪中，按照已经设定好的条件开始循环。
四：条件
50° 30min,95° 15min .(94° 45s,Tm-5°,72° 1min~undefined35cycle ,72° 10min ,----4°
待PCR仪中的温度降到4°时，取出RT-PCR产物，电泳，并置于-20°冰箱保存
无RNA酶水 ？
undefinedbuffer 5.0UL
DNTP Mix 1.0UL
Enzyme Mix 1.0UL
primer A ?(0.6M)
Primer B ?(0.6M)
RNA模板 ？（不大于1UL）
Q (RNA酶抑制剂） 可加可不加
二：虽说有几个试剂未知其量，但都是需要算的，给据要求，引物及RNA模板都可计算,具体如下：
1. 引物量的计算：
跟据引物说明书稀释引物，例如：
primer A 1OD 48UL 意思实说：1OD （一般公司给合成的为每管1OD,量为100M）引物加48UL 0.1%DEPC处理12小时以上并高压过的水，混匀，即为母液；然后取10UL于另一EP管中，加30UL0.1%DEPC处理12小时以上并高压过的水，用移液器吹打混匀，即为工作液。注明稀释日期及性质，-20度冰箱备用。
所需引物量为=(0.6undefined40Uundefined48UL)/(100undefined10UL)
同理 Primer B的计算相同 。
2.RNA模板的计算：
一般25UL反应体系中，需500ng或1ug的量，如按照1ug计算：
（1）总RNA浓度一定要知道:可通过测吸光度来计算，1OD=40ug，公式如下：
总RNA浓度=OD值40uundefined稀释倍数/1000 (ug/uL)
（2）所需RNA模板量为=1/总RNA浓度 (uL)
这样水的量就自然定了。
三：具体步骤
（1）先将所用的试剂放于冰盒上
（2）把除引物外的其它试剂都加好，用移液器混匀
（3）再加模板RNA并混匀
（4）将EP管放于已预热的PCR仪中，按照已经设定好的条件开始循环。
四：条件
50° 30min,95° 15min .(94° 45s,Tm-5°,72° 1min~undefined35cycle ,72° 10min ,----4°
待PCR仪中的温度降到4°时，取出RT-PCR产物，电泳，并置于-20°冰箱保存
