免疫学技术

噬菌体展示技术基本原理 噬菌体展示技术（phage displayed technology，PDT）是将外源蛋白或多肽与噬菌体外壳蛋白融合，展示在噬菌体表面并保持特定的空间构象，利用特异性亲和作用以筛选特异性蛋白或多肽的一项新技术。1985年Smith，G.P提出将外源基因插入改建过的噬菌体外壳蛋白基因，表达含有外源蛋白或多肽的融合蛋白，这种带有融合蛋白的噬菌体称为融合噬菌体。通过吸附- ...

噬菌体展示抗体库构建的载体 抗体库技术是将某种动物的所有抗体可变区基因克隆在质粒或噬菌体中表达，利用不同的抗原筛选出携带特异抗体基因的克隆，从而获得相应的特异性抗体 单链抗体（ScFv）是一种基因工程抗体，能够在原核宿主中表达，不论是在性能方面，还是在制备方面，均具有独特的优越性。关于基因工程抗体的特点与制备过程，见本书第一章的有关内容。这里仅介绍噬菌体展示技术在制备单链抗体中的应 ...

小鼠单链抗体表达库所设计的VH和VL引物VH FR1引物VL FR1引物15’-GGCTCGAGCAGGTT(G)CAGCTGC(A)AGCAGTCT(A)GG5’-CCTCTAGAGACATCCAGATGAC(A)CCAGTCTCC25’-GCTCGAGCAGGTG(A)CAGCTGG(A)T(A)GC(G)AGTCT(A)GG5’-CCTCTAGAGACATT(C)G(T)TGCTGACC ...

抗体库的构建 【材料和试剂】 （1）电转仪（2）电击杯（3）SB培养基（4）SOC培养基SB培养基经高压灭菌后，降温至60℃或60℃以下，加入20ml经过滤除菌的1mol/L葡萄糖溶液。50mg/ml氨苄青霉素水溶液，过滤除菌。10mg/ml 卡那霉素水溶液，过滤除菌。4% PEG溶液 【操作步骤】 （1）将第4步得到的连接物与300μl感受态细菌混匀旋转1min转 ...

PCR产物的酶切 经过电泳回收的PCR产物直接酶切的效果往往不佳。这主要是因为酶切位点太靠近片段两侧缺乏足够多的保护碱基。要克服这一问题要么在最初引物设计时加上较多的保护碱基要么用过量的限制内切酶长时间消化。而后者的效果并非特别理想。我们尝试首先将PCR产物互相平连再以过量限制性内切酶长时间消化得到了较好的效果。这种方案的潜在危险在于当酶切仍不完全时最后得到的片段两端很可能带有同一种酶的识 ...

PCR扩增模板和抗体可变区基因的扩增 如果构建Fab抗体库必需利用RT-PCR获取抗体基因;构建ScFv抗体库既可以DNA作模板也可以cDNA作模板。本室在构建小鼠ScFv抗体库过程中主要采用DNA作为扩增模板。【材料和试剂】（1）PCR仪（2）Taq酶（3）氯仿（4）琼脂糖【操作步骤】（1）在200μl离心管中混匀下列成分： 模板DNA 5μg 10×P ...

筛选多肽的试剂及配制LB培养基：胰蛋白胨 10g； 酵母提取物：5g； NaCl：5g溶于去离子水，至1L，高压灭菌，室温保存。IPTG/Xgal：称取1.25g IPTG，1.0g Xgal，溶于二甲基甲酰胺，至总体积25ml，-20℃避光保存。LB/IPTG/Xgal平板：1L LB培养基+15g琼脂粉，高压灭菌，冷却至70℃以下，加入1ml IPTG/Xgal，立即铺板，4℃避光保存。 ...

噬菌体展示技术筛选多肽 噬菌体肽库的构建 噬菌体肽库的构建多选用基因合成法，步骤类似于噬菌体抗体库的构建：即化学合成编码各种序列某一长度肽的寡核苷酸片段（如构建的肽文库是由6个氨基酸残基组成，就应含有206种不同的氨基酸序列，即约109种不同密码子的组合），然后通过DNA重组方法，插入到表达载体上的外被蛋白基因（如基因III或基因VIII）中，再利用电穿孔技术，将各种重组体转入大肠杆 ...

阳性克隆的筛选(panning) 一个筛选实验包括数轮识别和复制过程。在每一轮中特异性结合的克隆被选择和扩增。这些克隆在大约3～5轮之后便可居于多数。每轮的富集系数约为102～103因此3轮之后一个特异结合克隆将富集106～109倍。 【材料和试剂】 （1）ELISA板 （2）湿盒 （3）0.1mol/L Na2CO3(pH8.6) （4）3％BSA （5）TBS ...

分泌型ScFv的产生 【材料和试剂】 （1）SB培养基 （2）20mol/L MgCl2溶液 （3）50mg/ml 氨苄青霉素溶液 【操作步骤】 (1)将用ELISA检测有活性的克隆扩大培养制备质粒DNA。 (2)转化E.coli DH5α或 JM83(注意:必须是非supE菌株才能表达分泌型抗体); (3)挑选单克隆接种于10ml SB中其中还含有20m ...

ELISA检测噬菌体抗体与目的抗原的亲和力 【材料和试剂】 （1）酶标板 （2）酶标仪 （3）0.5mol/L Na2CO3(pH9.6) （4）1％BSA （5）HRP标记的抗M13噬菌体多抗 （6）2mol/L H2SO4 【操作步骤】 (1)将抗原用PBS或0.5mol/L Na2CO3(pH9.6)稀释至10μg/ml; (2)对于要检测的每个 ...

测序模板的快速纯化【材料和试剂】（1）真空泵（2）PEG/NaCl溶液（3）碘化物缓冲液（4）70%乙醇（5）TE缓冲液 10mM Tris-HCl，pH 8.0； 1mM EDTA【操作步骤】（1）扩增噬斑（见上述），在第一次离心后，将500ml含有噬菌体的上清转入新的离心管中。（2）加入200ml PEG/NaCl，颠倒混匀，室温静置10min。（3）离心10min，倾去上 ...

ELISA检测筛选到的靶分子结合肽【材料和试剂】（1）酶标板，酶标仪（2）湿盒（3）吸水纸（4）LB培养基（5）PEG/NaCl（6）TBS（7）0.1M NaHCO3（pH 8.6）（8）HRP底物缓冲液 ABTS贮存液：在100ml 50mM的柠檬酸钠溶液（pH 4.0）中溶解22mgABTS，过滤除菌贮存在4℃。【操作步骤】（1）噬斑扩增上清部分用于DNA序列测定，其余保存于4℃。（ ...

抗体的命名规则 近年来，已召开过多次描述种类的来源、免疫原和抗体类型标准的大会，并加以综合简单的做了一些规定，但需要做一些解释。免疫原通常根据种类的来源确定，前面总是加前缀“抗―”。所以，如果涉及针对脊椎动物刺猬(一种从鼠演化而来的动物)的抗体，就可将试剂写成抗鼠―刺猬的抗体，或者抗鼠―刺猬的免疫球蛋白。产生抗体的种属名总是放在抗体名称的前面，如果是在大角野山羊体内产生的抗体，相应的抗体就 ...

噬斑的扩增【材料和试剂】（1）恒温摇床（2）培养管（3）LB培养基（4）甘油【操作步骤】（1）以LB培养基稀释ER2537过夜培养物。1ml分装至培养管，每管中接种一个克隆。第三轮筛选后，每10个克隆就可能获得一个共同序列。（2）使用消毒牙签或枪头，穿刺噬斑，接种至上述培养管中。注意：要挑选噬斑数不超过100的平板上的噬斑，从而保证每一个噬斑仅包含单个DNA序列。（3）37℃振摇孵育4.5~5 ...

索取（购买）抗体的环节 所有已发表文献中描述的抗体，只需向作者礼貌地提出申请均能获得，只有当多抗已用尽或者供应非常短缺，作者才会婉转地拒绝。所用单抗一般都会毫无保留地提供，而多克隆抗体的产量有限，不足以为申请者提供大量所需试剂。如果抗体生产是为了销售，申请人应该付款。在需要大量抗体时，如制备抗体亲和柱，有时为获得足够的抗体和纯化的抗体，申请人和抗体提供者间应寻求一个可接受的解决办法。 ...

基因组高通量测序 在最近几年中，高通量测序技术已经由以凝胶板为基础的方法(例如“S放射标记测序手册、ABl 373、ABIPRISM 377、Li-corIR2型DNA测序仪)发展到毛细管测序仪(如ABI Prism 3100、3700和3730xl型DNA测序仪，Megabace1000和Megabace 5000)测序，已有关于制备DNA和测序的方法及设备的评论发表(Meldrum，2 ...

基因组分析注释流程 所有的大规模测序中心都依赖功能强大的生物信息学支持，以分析它们产生的海量数据。分析的水平和类型多变，但是其共同需求就是结合多种注释证据，为注释者和公众提供便于使用的界面的稳定工具。在TIGR，基因组注释工具的应用在过去几年中不断发展，已将自动开放阅读框(openreading frame，ORF)识别、非ORF特征识别、数据库匹配、基因的功能分类结合在一起。Glimme ...

比较基因组学 综合微生物资源(comprehensivemicrobialresource，CMR)储存所有已测序微生物基因组的数据库(Peterson等，2001)。它提供给科研团体关于比较基因组学的基因组中和基因组间相互关系、基因组多样性、进化研究的信息。它显示完整基因组分析结果，例如基因组范围联配点图、圆形示意图、多个物种之间共有基因的表格。这一界面根据基因的性质进行多种数据提取，包 ...

噬菌体肽库的应用一、在生物活性小肽筛选方面的应用 具有生物活性的小肽，如酶抑制剂，受体的激活剂或拮抗剂等，具有重要的基础研究及应用价值。因此，寻找和研究这些小肽一直是生物化学和药物研究中的一个热点。通常，这些小肽可通过合理的体外设计师合成或从化学合成的混合物中分离。但前者需要详细的分子结构信息，而后者又费力、耗时且价格昂贵。而通过噬菌体表达的随机肽库技术则可简便有效的筛选到高活性的小肽，而 ...