免疫学技术

流式细胞术分离法分离T淋巴细胞和B淋巴细胞【试剂及配制】（1） RPMI-1640培养基：应选购不含酚红的，使用时加入5%的小牛血清。（2） FITC-抗CD3单克隆抗体：FITC为异硫氰酸荧光素，CD3为T细胞表面特有的蛋白质分子（分化抗原）。【操作方法】（1） 用聚蔗糖-泛影葡胺密度梯度离心法分离单个核细胞，用RPMI-1640培养基配成1×107 /ml；（2） ...

密度分离法分离单核细胞 单核细胞只占末梢血白细胞的3%～5%，比重与淋巴细胞近似，用离心的方法很难将二者分开。而利用上述贴壁法也很难将两者分开，且有损伤细胞及回收率低等缺点。现可用以下两种方法获得量较多且纯度较高的单核细胞。1．Colotta方法【试剂及配制】（1） pH 7.2 PBS液（2） 聚蔗糖-泛影葡胺分层液（D=1.077）（3） ...

吸附分离法（贴壁法）分离单核细胞 单核细胞具有吸附于固相表面的特性，把单个核细胞放于玻璃或塑料平皿内，37℃于孵育一定时间后，吸附于平皿壁上的细胞即为单核细胞，未吸附的细胞即为淋巴细胞。【试剂及配制】（1）含5%小牛血清PRMI-1640培养基。（2）Hank’s液。【操作方法】（1） 含5%小牛血清PRMI-1640培养基将单个核细胞配成细胞悬液，将细胞悬液置于玻璃或 ...

人外周血中性粒细胞制备 利用右旋糖酐加速红细胞沉降，将富含白细胞的上层液用淋巴细胞分层液进行离心分离，使粒细胞沉于管底而与淋巴细胞和单核细胞分离。（一）小量分离法【试剂及配制】（1） 6%右旋糖酐生理盐水（2） 聚蔗糖-泛影葡胺分层（D=1.077）（3） 0.83% NH4Cl溶液：取0.83g NH4Cl、0.1g KHCO3 、0.0 ...

聚蔗糖-泛影葡胺法分离嗜碱性粒细胞【试剂及配制】（1） 聚蔗糖-泛影葡胺分层（D=1.085）（2） HEPES-ACM缓冲液：HEPES 25mmol/L中含CaCl2 1mmol、 NaCl 130mmol、 KCl 5mmol、 MgCl2 1mmol用1mol/L NaOH调节至pH7.4。（3） 无Ca2+、Mg2+Hank’s液【操作 ...

组织肥大细胞的分离肥大细胞不存在于循环血液中，需从有关组织如胃肠道和肺组织中获取，下面介绍从胃肠道组织中用机戒破碎，酶消化后获得肥大细胞的方法。【材料和试剂】（1） 肠片段3～5g（2） 含5% NCS的HBSS（3） 0.9%生理盐水（4） 含20% NCS和1ug/ml胶原酶的HBSS（5） 含20% NCS和 ...

嗜酸性粒细胞的分离嗜酸性粒细胞在支气管哮喘、过敏性鼻炎等发病过程中起重要作用，研究其功能需要制备高纯度和高活力的嗜酸性粒细胞。以下介绍一种根据中性粒细胞膜选择性表达FcγRIII（CD16），采用包被有抗CD16单克隆抗体的磁珠，通过负性选择方式快速简便的分离脐血嗜酸性粒细胞的方法。【试剂及配制】（1）各种比重的聚蔗糖-泛影葡胺分离液A液：12% 比重1.090的聚蔗糖-泛影葡胺分离液B液：9 ...

树突状细胞（DC） 树突状细胞作为一种重要的抗原提呈细胞，参与免疫应答的启动和调节。它具有一些不同于其他细胞的特性如粘附性（过夜培养后，便失去粘附性）、比重较低等。人外周血中DC含量很少，仅占单个核细胞的0.1%～1%。利用细胞粘附和密度梯度离心的方法虽然可分离纯化外周血树突状细胞，但此法分离的DC，不仅纯度低，数量少，而且处于不同的分化阶段，已难以满足临床研究的需要。随着人们对DC发生学 ...

免疫荧光染色技术检测各类免疫细胞的数量 免疫细胞在各自正常分化成熟的不同阶段以及活化过程中，其细胞膜表面均表达可供鉴别的特殊结构，即表面标志。其中CD分子常作为各类免疫细胞的表面标志用于免疫细胞的鉴定和分离以及用于检测在不同状态下某类免疫细胞数量的变化，能够反映机体免疫功能状态，有助于研究某种疾病的发病机制，为疾病的诊断和治疗提供依据。【基本原理】 利用荧光素标记抗人T细胞亚群的单克 ...

免疫酶染色技术（ABC法）检测各类免疫细胞的数量 抗体与相应抗原结合后，形成抗原抗体复合物，然而这种复合物在显微镜下是不可见的，如将特异性抗体与酶结合，再通过适当的底物显色，就可使免疫复合物由不可见而成为可见，从而确定组织细胞是否存在某种抗原。免疫酶染色技术正是根据此原理用酶（如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等）标记已知抗体（或抗原），然后与组织细胞在一定条件下反应，如果组织细胞中有相应抗原或 ...

流式细胞仪术检测各类免疫细胞的数量 流式细胞术（FCM）是一种高速度、高灵敏度、高精度和高分辨率的自动分析细胞的高新技术。主要用于定量分析单细胞表面、细胞内抗原和对分子水平的核酸含量的测定。【试剂及材料】（1） FITC（或PE）标记的抗CD的mAb及正常小鼠IgG（2） 细胞洗液：含2%BSA、0.1%NaN3的PBS。（3） 固定液：2 ...

微量细胞毒试验检测各类免疫细胞的数量【基本原理】 在补体存在的情况下，针对淋巴细胞CD分子的McAb与相应的CD分子结合，可将细胞杀死，其细胞膜失去屏障作用而使伊红染料透入细胞内，使之染呈红色。而无相应CD分子的细胞则不受损伤，因而不着色。计数死亡细胞数，即可判断待检细胞是否具有相应的CD分子，从而确定T细胞的亚群。该方法简便易行，准确性较高。【试剂及材料】（1） 新鲜兔补体（ ...

红细胞花环法检测各类免疫细胞的数量【基本原理】 采用戊二醛交联技术将McAb或兔抗鼠IgG与羊红细胞（SRBC）结合，制成致敏的SRBC。抗体致敏的SRBC可与T淋巴细胞直接或间接结合，在T淋巴细胞周围形成花环。通过计数花环形成率，从而确定T淋巴细胞各亚群。该方法可分为直接红细胞花环法和间接红细胞花环法。现以间接花环法为例。【试剂及材料】（1） 醛化二抗致敏的SRBC（2） ...

MTT比色法【基本原理】 MTT法是Mosmann 1983年报道的，以后此方法得到了迅速发展并广泛应用于临床与科研研究。其原理是活细胞内线粒体脱氢酶能将四氮唑化合物（MTT）由黄色还原为蓝黑色的甲肷，甲肷的生成量与细胞的增殖程度呈正相关。后者溶于有机溶剂（如二甲亚枫或酸化异丙醇等），并可在560nm波长下进行检测。【试剂及材料】（1） MTT：用PBS配成5mg/ml的 ...

T、B淋巴细胞功能测定 淋巴细胞功能测定可分为体内试验和体外试验。体内主要是进行迟发型超敏反应，借此间接了解淋巴细胞对抗原、半抗原或有丝分裂原的反应；体外试验方法包括淋巴细胞对抗原或有丝分裂原的增殖试验、细胞毒试验以及其分泌产物功能的测定（淋巴因子的测定见第八章）。淋巴细胞功能测定不仅能够了解机体免疫功能状态，而且是免疫缺陷病诊断的主要依据，也有助于探讨某些疾病的发病机理、疗效判断、推断转 ...

3H-TdR掺入试验【基本原理】淋巴细胞受特异性抗原或有丝分裂原刺激后，在转化为淋巴母细胞的过程中，DNA的合成明显增加。且其转化程度与DNA的合成呈正相关，此时若将合成DNA的前体物质胸腺嘧啶核苷用放射性同位素（3H -TdR）标记，加入到培养体系中，即被转化的淋巴细胞摄取而掺入DNA分子内。培养终止后，测定淋巴细胞内掺入的3H -TdR的放射量，就能判断淋巴细胞的转化程度。此方法较客观、精确 ...

MHC/多肽四聚体法检测抗原特异性T细胞数量T细胞通过其表面TCR特异性识别抗原呈递细胞表面的MHC/抗原肽复合物后，被活化和发生增殖，进而分化成效应细胞。因此，可以用MHC/抗原肽复合物检测T细胞表面的特异性TCR，来反映抗原特异性T细胞数量的变化。 Altman等首次发明MHC/多肽四聚体方法并应用于检测可识别HIV抗原肽的特异性CTLs，获得成功。后经Walter等改进，成为检测和 ...

XTT比色法【基本原理】 XTT比色法有Scudiero等首次采用，用于检测细胞增殖。XTT是异种与MTT类似的四唑氮衍生物，可被活细胞线粒体脱氢酶还原成水溶性的棕色甲肷产物，当XTT与电子偶合剂共同使用时，甲肷的生成量与细胞的增殖程度呈正相关。【试剂及材料】（1） XTT：用60℃预热培养液配制成6.6mmol/L，过滤除菌，现配现用。（2） 吩嗪二甲酯 ...

特异性抗原诱导的细胞毒性T细胞功能测定【基本原理】 本方法先借助长期混合淋巴细胞培养法获得抗原特异性CTL，然后再进行细胞毒试验。其原理为：外周血淋巴细胞包含针对不同抗原的特异性CTL克隆，在体外经某一特定（或同种异体细胞）抗原刺激后，能识别该抗原的T细胞克隆被选择性激活、增殖，而其他T细胞克隆则逐渐死亡；经3~4次刺激后，存活的均为识别特异性MHC/抗原肽复合物的细胞，即抗原特异性CTL ...

单向混合淋巴细胞培养【试剂及材料】（1） 供者和受者淋巴细胞悬液：浓度调至1×106/ml。（2） 丝裂霉素C：用培养液或PBS配制300μg/ml。（3） 含20％NCS的RPMI-1640完全培养液（4） 3H-TdR【操作方法】（1）刺激细胞的制备:取淋巴细胞1×106，加入最终浓度为30μg/ml的丝裂霉素C，于37℃水浴 ...