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        人外周血中性粒细胞制备

        互联网

        13182

        利用右旋糖酐加速红细胞沉降,将富含白细胞的上层液用淋巴细胞分层液进行离心分离,使粒细胞沉于管底而与淋巴细胞和单核细胞分离。

        (一)小量分离法

        [试剂及配制]

        (1)6%右旋糖酐生理盐水

        (2)聚蔗糖-泛影葡胺分层(D=1.077)

        (3)0.83% NH4 Cl溶液:取0.83g NH4 Cl、0.1g KHCO3 、0.0037g EDTA.Na2,蒸馏水加至100ml。

        (4)0.1%白明胶Hank’s液。

        [操作方法]

        (1)取3~10ml肝素抗凝血,加1/4体积的6%右旋糖酐生理盐水,混匀后在室温静置30~45min,使红细胞下沉;

        (2)取上层细胞按1:1比例叠加到聚蔗糖-泛影葡胺分层液面上,500r/min离心30min;

        (3)将沉淀细胞用0.83% NH4 Cl溶液破坏红细胞,离心洗涤后,悬于2~3ml 0.1%白明胶Hank’s液中,计数并调整细胞浓度;

        (4)取细胞液涂片,分别作台盼蓝拒染试验和Giemsa染色,鉴定其存活率与纯度。

        (二)大量中性粒细胞的分离方法

        [试剂及配制]

        (1)Percoll:将购买的Percoll(Pharmacia)用10×HBSS(无钙、镁)按9:1的体积比配成储备液,该浓度被认为100%。再用1×HBSS(含10mmol/L HEPES,pH7.2)将100%的Percoll稀释成81%、70%、55%的浓度备用,其密度分别为1.100、1.0875和1.0697。

        (2)葡聚糖:将Dextran T-500 用PBS配成4%的浓度。

        (3)离心梯度的配制:取将5ml 81%的Percoll加入17×100mm的离心管底,然后依次加入3ml 70% Percoll和4ml 55% Percoll即可。

        [操作方法]

        (1)将全血 3000r/min离心3~5min;

        (2)取40ml淡黄色细胞层与4% Dextran混合;

        (3)5min后,将80ml 2% Dextran加入悬液中,然后将混悬液倒入50ml的离心管中,让其自然沉淀30min;

        (4)取Dextran沉淀后的“上清部分”,150g离心8min,并用PBS洗涤2次;

        (5)将细胞(约5×106 /ml)加入梯度离心的最上层(即55% Percoll层),10℃,1600r/min离心20min;

        (6)离心后将产生3条细胞带,其中带2中性粒细胞约占96.5%;

        (7)取出细胞,用HBSS洗涤后配成所需浓度。

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