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        XTT比色法

        互联网

        24753

        [基本原理]

        XTT比色法有Scudiero等首次采用,用于检测细胞增殖。XTT是异种与MTT类似的四唑氮衍生物,可被活细胞线粒体脱氢酶还原成水溶性的棕色甲肷产物,当XTT与电子偶合剂共同使用时,甲肷的生成量与细胞的增殖程度呈正相关。

        [试剂及材料]

        (1)XTT:用60℃预热培养液配制成6.6mmol/L,过滤除菌,现配现用。

        (2)吩嗪二甲酯硫酸盐(PMS):用PBS配制成220mmol/L,4℃避光保存20天。

        (3) XTT/PMS:XTT与PMS按1:1混合(临用时混合)。

        [操作方法]

        (1)刺激增殖反应同前;

        (2)于终止培养前2h,每孔加入XTT/PMS 20μl,混匀后再培养2h;

        (3)在酶标仪上450nm处测定光吸光度,参考波长为655nm;

        [结果分析]

        计算SI:SI=试验孔OD均值/对照孔OD均值

        [注意事项]

        (1)丝裂原的质量和活性是测定淋巴细胞增殖反应的关键因素。不同厂家的产品,质量、活性不同,其使用的最佳刺激量也不同,因而在实验前,应事先确定其最佳刺激量。

        (2)检测T细胞增殖反应,丝裂原用PHA或ConA;B细胞增殖反应用LPS或SPA;T、B细胞增殖反应则用PWM。

        (3)增殖反应的细胞应保持高活性,一般应≥95%。应用单抗分离制备的反应细胞因保存剂(如NaN3 )或抗体的直接作用可抑制细胞的增殖。此外,增殖细胞的浓度过高或过低均不利于细胞生长。

        (4)细胞培养液应无菌、无支原体污染,特别是小牛血清应加热灭活补体,避免LPS或其他能促进细胞增殖物的污染。因此,实验前应选择本底低的小牛血清。用人"AB"型血清或自体血清也应加热灭活补体。

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