细胞技术

黑洞里的鱼 请教一下，启动子区（-5kb~0kb)指的是mRNA的5'端上游5kb内，还是对应的DNA的sence strand的5'端（即编码mRNA的DNA链对应的那条链）？如果是miRNA，假设pre-miRNA上游即（-5kb~0kb)区域是他的启动子区，那这个区域是pre-miRNA的5'端的（-5kb~0kb)吗？还是转录pre-miRNA对应的DNA的5'端？在miRbase查到hsa-mir-140的pre-miRNA ...

angel880627 最近因课题需要，要构建基因沉默的小鼠模型来进行试验，有木有大侠知道得到慢病毒载体后该如何构建小鼠模型？文献里写的都很模糊，实验室里有没有师兄师姐做过，还望有经验的大虾能给点指导，越具体约好啊~~~majilee 你说得也很模糊1.是要小鼠体细胞都沉默的话 需要从es细胞开始2.另外一种是中国人很常见很经常做的 慢病毒包装好后注射老鼠angel880627 从ES细胞做起是要怎么做？我看到有的文献在构建的时 ...

能nca 实验室的DEPC水，处理了一年多了，是以前师姐装在EP管得，实验一直就用这个做实验，这个水这么久了还能用吗还有70%的乙醇也是用这水配制的，也放了一年多了还能用吗？devil19840 只要保存得当，容器干净、没有别的东西污染，应该就没问题volano 俺待过的实验室，DEPC处理过的水，4度只保留一周。 勤配，少量配，尽量用新鲜的，不然到时候RNA作不出来，找原因还得排除一条DEPC水有没有过期呀？何必呢，平时多勤快点， ...

habaside543120 钾后面的加号是一个上标，，，和HEPES写在一起，，不知道这个东西怎么配也？？有人可以指点一下吗？？habaside543120 studypeople hepes做PH缓冲剂，浓度是10mmol，最后调PH的时候，用KOH调，应该就行了本文由丁香园论坛提供，想了解更多有用的、有意思的前沿资讯以及酷炫的实验方法的你，都可以成为师兄的好伙伴师兄微信号：shixiongcoming

g_qhzhang 哪位大侠能够告诉我用荧光染色剂fluo-3/AM测量细胞内钙离子浓度应注意什么？谢过了先g_qhzhang 之前看到园子里有战友讨论荧光染色剂fura-2觉得非常好，对这方面了解很少，被热心战友推荐用fluo-3/AM，不知两个有何区别，只知是2代和3代，希望得到各位大侠指点。婷子 fura2 做流式细胞仪检测fluo3AM 做激光共聚焦好点，但网上看到也有用于流式细胞仪检测的。我之后也要做这个，只是还没找到fl ...

小猪爬墙 如果我要寻找转录因子的下游因子怎么做，比如我发现基因A表达下调了可以导致TGF通路表达下调，想研究其中的机制，具体我该怎么做呢，导师天天催，我都急死了，盼您赐教啊。小猪爬墙 http://www.bioon.com.cn/doc/showarticle.asp?newsid=26539小猪爬墙 http://www.doc88.com/p-47430825856.html本文由丁香园论坛提供，想了解更多有用的、有意思的前沿资讯 ...

郑哲 我要做miRNA的干扰实验，体外注射mimics，然后看它对靶基因的影响，想知道实验要具体怎么设计呢，要怎么做对照，而且不明白什么是阴性对照，希望大家帮助predator 不知道你的mimics的注射对象是什么，是细胞，还是动物？公司合成mimics时会有阴性对照，可以咨询公司。tntztyx 关注中～～～本文由丁香园论坛提供，想了解更多有用的、有意思的前沿资讯以及酷炫的实验方法的你，都可以成为师兄的好伙伴师兄微信号：s ...

紫贝壳li 课题研究外源分泌蛋白与宿主细胞的相互作用，现有一分泌蛋白能粘附于Hela细胞膜，引起后续一系列反应，但作用位点未知，且该蛋白作用于细胞膜，但未被吞噬进胞内，求怎样检测该蛋白粘附于膜的量大鹏鸟 定性可以用免疫荧光，定量也可以大概的用免疫荧光看看。smartchow 定性用免疫荧光做，具体方法：1、做Hela细胞的细胞爬片2、用5%BSA的PBS溶液去封闭，3、用你的外源分泌蛋白与之结合（外源分泌蛋白溶于PBS中，具 ...

江janice 求助：用的是天根 的胶回收试剂盒，11管PCR产物，差不多500微升的总体积，上四个孔电泳，电泳后用天根的盒子回收到四个EP管，每管40微升，取5微升电泳，居然没有成功，又取10微升电泳还是没有任何条带，不知道可否有人用天根的盒子，是否遇到这方面的问题，一般100微升的PCR产物，回收到多少体积比较恰当，纠结啊，回收了好几次电泳都没有目的条带，盒子是刚买的新盒子，谢谢好心人帮助大鹏鸟 天根的盒子还是很好用的，注 ...

wori1123 我的研究课题需要动态观察细胞内钙离子浓度，大概每隔10秒观察一次，想跟大虾们请教下怎么样能解决连续观察时温度的恒定问题，因为试了好多次都不行，谢谢DarrenWONG 您要观察多久？几分钟？几小时？用Fluo-4的Flexstation 或 Flipr （Molecular Devices公司）可以实时检测细胞钙流（比如加药后），可以控制温度、湿度，但是读出来的荧光信号，没有图像，而且细胞检测后就废了。显微镜观察的话，用 ...

小猪爬墙 各位大虾好，想请教大家下信号通路的实验怎么设计，我的实验是已发现基因A可调节癌基因B的表达，基因A下调可以使癌基因B表达降低，同时某miRNA可以下调A基因表达，能否设计实验通过人为上调某miRNA下调A基因表达，进而使得癌基因B表达降低呢？请教是否可行？我看通路设计中一般都需要敲除中间的某个基因以验证其作用，我的实验设计中上调miRNA后检测基因A然后检测基因B表达，实验中是否需要敲除基因A然后再检 ...

尘朵朵 请问用过transwell小室的战友们，你们用它种细胞时的密度+时间是多少啊（加药之前）。我每次也没计数，就是一个25cmXcm的培养瓶，长满之后消化，每个小室种250ul细胞，一共12个小室，长至第二天约16小时。不知道是否太满了？请各位提出宝贵意见哈！先谢谢了！ciliary 你好，我每次都是计数的，养的是HUVEC，每孔细胞数为5×10^4，每孔是100ul，一般测迁移，6-8小时就可以了，我最长做过24小时，觉得 ...

tu_guiyun98121 各位大侠好。本人准备做转染细胞，用的试剂是invitrogen的lipofectamine 2000。因为是初次做，有几个问题想请教一下各位高手。谢谢！1。质粒DNA抽提完后（用除内毒素试剂盒），是否需要除菌。如果需要，一般用什么方法？2.如果是做瞬时转染，是不是可以不用线性化质粒，而是提完质粒就可以直接用于转染。如果是稳定转染，就要先酶切质粒，使其线性化，然后再转染。3.invitrogen的l ...

superskyfly 我自己都觉得我自己很牛，千百人都做出来的试验，我就是做不出来。质粒用的是Promega p4.32-NF-kB-Luc, 转染用的是Invitrogen的Lipofactamin, 激活用的是Sigma生产的PMA和PHA-P,Assay用的是Promega dual,结果加了PMA和PHA的和不加的读数几乎没有区别。加了compound的和不加的也没有区别。用过PC3, Jurkat, A549，HCT116都是一样 ...

xiaozhangwei2 P53的翻译后修饰都有哪些？听说有磷酸化和乙酰化。还有其他的吗？怎样找出P53是发生了哪种修饰变化？如何设计实验验证P53修饰后，与靶标启动子结合时，有没有产生结合活性的变化啊？谢谢！大鹏鸟 p53的修饰正常细胞在非应激状态下p53的水平和活性都较低，受到应激作用时，p53通过一系列的翻译后修饰被活化，并能结合特异的DNA序列。翻译后修饰是调节蛋白质功能的一个主要机制，p53在多个位点上可 ...

xiaozhangwei2 做的病毒。被指定了一个新方向，假设X病毒可以诱导P53的翻译后修饰，使其不再与靶基因结合。应该设计哪些实验来验证呀？ （病毒诱导的P53翻译后修饰种类可能为磷酸化或者乙酰化，不确定。）完全没有信号传导方面的经验，还请多多指教。希望可以简短的把所需要做的实验罗列一下,怕自己是新手，考虑不周全。谢谢！大鹏鸟 1、X病毒诱导后，用磷酸化或者乙酰化抗体检测P53的变化。2、X病毒诱导后检测P53-Lucif ...

ilovelc999 请问各位，提质粒后，用20微升TE溶解，然后进行电泳，应该用10乘Loading Buffer 还是用6乘Loading Buffer？另外Buffer与质粒溶液一般应以什么比例混合好呢？多谢各位啦！纯属菜鸟 10乘 5：1的比例 质粒5肥宝 我是用6X的，1:5，质粒5，不过也没那么严格，一般也就点个小点估计1ullihuijin017 都可以，按比例就好！没那么严格ilovelc999 恩恩，多谢各位了！本文由丁香园论坛提供，想 ...

ilovelc999 很着急，不知道10mmol/L的Tris-HCl(pH8.0)如何配制？有哪位知道吗？麻烦告诉我一下好吗。mybbff 先配成10mM的，水先不要加足，调节pH到8.0后再定容到预定体积。ilovelc999 恩，知道啦，多谢版主！wangbingying66 1.称取1.211g Tris2.加800ml去离子水，充分搅拌溶解3.加420μl HCL4.加去离子水定容至1L5.高温高压灭菌注意：应使溶液冷却至室温后再调P ...

qiangshou2010 我最近转染Frhk-4细胞株，用QIAGEN和lipofectamine 2000/RNAiMAX都不能将siRNA转进去。前几天用了Engreen的一个试用装，感觉是转进去了，但是老师说不一定。siRNA荧光和细胞不像是在同一平面？下面是图，大家帮忙看一下，谢谢。qiangshou2010 我观察前用pbs将细胞洗了两次，这个过程能不能将细胞膜上的siRNA洗掉呢？芦宏 我建议你看一下转染效果，做 ...

zhoujianheng 哪位大侠有较完整清晰的PI3K/Art信号通路图，谢谢chengbin1217 爱玩的小瓶子 共同学习吧 加油guojunling1201 你好！你找到了吗、能不能发给我一份？大水牛11678 guojunling1201 wrote:你好！你找到了吗、能不能发给我一份？冷枫之孤独王者 cell signaling technology上有本文由丁香园论坛提供，想了解更多有用的、有意思的前沿资讯以及酷炫的实验方法的你，都可 ...