【求助】NF-kB luciferase

我自己都觉得我自己很牛，千百人都做出来的试验，我就是做不出来。质粒用的是Promega p4.32-NF-kB-Luc, 转染用的是Invitrogen的Lipofactamin, 激活用的是Sigma生产的PMA和PHA-P,Assay用的是Promega dual,结果加了PMA和PHA的和不加的读数几乎没有区别。加了compound的和不加的也没有区别。
用过PC3, Jurkat, A549，HCT116都是一样。
过程是第一天seeding,第二天换low serun的opti-MEM加lipofactamin,Renilla,和我的质粒过夜。第三天加compound,incubate一个小时以后加PMA,PHA，在incubate6个小时以后测量。Empty vector的读数和NF-kB的读数差很远，我想Transfection还是成功的。但是加了PMA和PHA的和不加的读数几乎没有区别。加了compound的和不加的也没有区别。 raw ratio 都在15左右。请高手赐教，不胜感激。

你的质粒是过表达的还是降低表达的质粒？你所检测的时间窗口是以前做过已经确定了在刺激6个小时后可以检测到变化的还是初次探索的？如果是后者，时间窗口不确定就尝试着增加观测的时间，比如8个小时，12个小时，16个小时等分别观测，找到一个最佳时间窗口。我也在做相关方面的试验，目前也有很多问题需要解决。希望可以从你这儿学习一些宝贵经验啊

Promega p4.32-NF-kB-Luc,这个质粒没有用过，不过在我们的系统里一般都用TNFa刺激，只有在血液肿瘤细胞或免疫细胞才用PMA or LPS刺激。找找文献看看pma能否激活你的质粒，最好是相同的细胞系。不然改用细胞系或刺激剂可能是个好的选择。