蛋白质技术

owen79 各位大侠，小弟还想问一下用WESTERN BLOT检测小鼠肝脏NF-KB的时候，肝匀浆以后离心的转速和时间是多少啊？还有就是取肝脏的时候怎样把肝脏的血方的干净点啊？影响离心。haodanzhang 12000转，4°或者常温都可以。chuckdouble owen79 wrote:各位大侠，小弟还想问一下用WESTERN BLOT检测小鼠肝脏NF-KB的时候，肝匀浆以后离心的转速和时间是多少啊？还有就是取肝脏的时候怎样把 ...

taohill 最近需要做过表达，有以下几个问题：1 克隆CDS,还是cDNA?2 该蛋白有两个剪切体，选那个呢？3 哪个数据库有蛋白表达谱？谢谢woxingwosu 你的概念比较模糊：1：克隆的时候当然是逆转录形成CDNA后去PCR克隆2：选哪个剪切体要看你的实验目的，是做一个还是两个都做3：看看www.genecards.com和http://www.wikigenes.org有没有蛋白表达谱了taohill thanks!taohill ...

keep-smile 最近在做原代培养的神经细胞的凋亡研究。对于六孔板中蛋白提取有些疑问。药物处理后，总有一些细胞漂浮起来，估计就是凋亡或坏死细胞，直接吸弃培养基怕对凋亡相关蛋白检测有影响。如果细胞消化离心，又担心提取不够迅速使一些目的蛋白去磷酸化，比如MAPK信号通路蛋白。请问大家，应该怎么解决这个问题呢，有什么好的办法？ronaldo_zj 1. 我们也遇到过类似问题，但经过检测，我们发现培养基上清漂浮的细胞确实就是晚期 ...

owen79 各位大侠好，小弟愚问一下，我想测定NF-KB活化后细胞核内的量，这需要提取核蛋白，但是蛋白量太少，提取出来能否测出NF-KB啊！thank you !ronaldo_zj 1. 通过提取细胞核、细胞浆内的蛋白来行western blot检测NF-kappa B 的表达情况是可以的，因为很多时候是通过NF-kappa B转位来实现活化的，所以提取的时候我不知道楼主是自己配制试剂提取还是用试剂盒提取的，我建议可以将2-3皿细胞（当然是相同的 ...

yellowtree 各位大虾，我目前使用PI3K抑制剂LY294002，MEK抑制剂PD98059，JAK抑制剂AG490处理细胞后，要观察他们的抑制效果，那我该买什么抗体做western检测呢？每个信号通路都有那么多蛋白，应该选择哪一个呢。谢谢各位啦kern6549 抑制什么蛋白就检测什么蛋白。mishmoth 检测下游分子，如pPI3K的下游是Aktaileen83 一般是检测下游蛋白，如果下游蛋白因为抑制剂处理而未 ...

zhangqiang6612 最近做wb时，转膜后mark很淡，几乎没有转膜条件：300mA，恒流 45min，分子量大小40kd丽春红染膜后，条带很淡转膜液配方：Tris 5.8g，甘氨酸2.9g,甲醇200ml/L,补足液体(去离子水)至1000ml请高位高手指点蓝天飞龙 有图吗？zhanghai123 没有SDS?zhanghai123 还有1g SDSaileen83 我做western的转膜缓冲液：Tris:3g, Glycine:14.4g, ...

naj2007 请教一下各位老师，在构建过表达载体的时候，VEGF和GFP是不是不可以做成融合蛋白，但是如果用不同的启动子的话，很容易丢失荧光，有没有什么解决方法。zhujoker 可以做成融合蛋白的，即使是使用不同的启动子的话荧光也不那么容易丢失的，大不了你将荧光的启动子换成强的如CMV，EF1a之类。kinguangjun 或者你可以用CMV-VEGF-IRES-GFP来做也可以，这样用一个启动子CMV同时表达两个蛋白 ...

panxiaoyun1115 各位大侠，请问MMP13可以做明胶酶谱法，用来区分MMP13的前体酶原和活化的MMP13吗？非常感谢！急盼！zhujoker 明胶酶谱法主要是用来检测有活性的MMPs，所以理论上应该可以区分开的panxiaoyun1115 版主，有活性的MMPS就是指活化的MMPS吗？或者是指：pro-mmps和活化的mmps，只要没有被特异性抑制物（TIMP）结合，都称为有活性的MMPS？谢谢！峰朗月白 回复楼上 ...

tony3436 本人是个入门级新手，系里课题极少，没捞着练手，实验技术匮乏，特请高手指点：我想研究一蛋白的表达量及定位。目前考虑给蛋白加一GFP标签。但具体的蛋白序列，引物设计等步骤一无所知。希望高手赐教。不甚感激！kinguangjun 你好！你可以考虑用clontech的pEGFP-C1或者pEGFP-N1真核表达载体，把你所要做的蛋白和GFP融合在一起，然后转染细胞，就可以判断其蛋白的定位了，若要判断其表达量做We ...

diving 做转录因子的WB必须要用核蛋白提取吗？平时的总蛋白提取包括核蛋白吗还是核被离心掉了？有时候好像有人直接提取总蛋白做磷酸化的检测了，为什么？xhjggl 还是选择使用专门的核蛋白提取试剂盒吧，一般而言，总蛋白提取时核蛋白的提取效率不高diving 提取总蛋白然后做的磷酸化水平比如P-Stat 有意义吗xhjggl 总蛋白然后做的磷酸化水平效果不好diving 谢谢！paroxysm 看情况吧。比如STAT3是通过705和 ...

伊果 目前我通过原核表达系统获得一个可溶性蛋白，是一个原核生物蛋白，目的是想看看它是否为一真核生物死亡受体的配体。请问需要做什么实验，提供怎样的证据才有说服力？谢在先！LoftyMan 1. 该蛋白刺激细胞，观察受体和受体下游分子的表达情况有没有变化2. 该蛋白刺激细胞，该死亡受体的激活会引发什么？知道的情况下看该情况是否发生3. Luc4. IP加IB5. confocal和FRET伊果 若用蛋白直接刺激细胞，蛋白需要在固相包被么？死亡受体是 ...

jasedm 看到文献好多都说，某蛋白被磷酸化，其活性增高，继而磷酸化下游的信号分子。AKT激酶活性测定和Western blot检测其磷酸化水平两者都能说明AKT的活性吗？有什么不同吗？两者有没有可能测定出来的结果不同？例如说AKT磷酸化水平没变化，但是激酶活性检测结果是活性降低？AKT磷酸化就代表它有活性吗？谢谢高手指点xiaoxiao53 很有价值的问题，AKT磷酸化就应该是有活性吧阿兰梦 测活性和测磷酸化的蛋白表达 ...

will99_04 小弟想用pGL3-vector basic作为载体装载一个启动子片段，该启动子片段需要经PCR克隆，故要设计引物，在引物的5‘端加入内切酶位点。经过查询后发现可以用一下三种内切酶：KpnI，NheI，MluI查TAKARA的产品目录后发现，这三种酶的反应温度均为37°，但所用缓冲液不同。提问：有没有适合两种酶（从上述三种同时反应的universal buffer（通用缓冲液）？devil19840 查看taka ...

dmdfe 本人将GFP基因后面加了一段大约110bp的序列，插入PET28A的BamH1和Hind3位点，最后在BL21中表达。经SDS-PAGE验证表明：目的蛋白 大量存在菌体裂解后沉淀即包涵体中，但是该沉淀无色。少量存在于上清中，上清显微弱的绿色。看文献大量报道GFP融合蛋白几乎都形成可溶性表达，目的蛋白在上清中，并且诱导条件没有太大要求。想请教一下各位做过GFP原核表达的经验，本人应该怎么改进条件（本人用37度 ...

lingwu 做WB,加入药物，发现p-AKT在60min表达才开始上升，而其他信号分子在15min内就表现出磷酸化增加，这种现象如何解释，p-AKT在60min表达上升有什么意义？kern6549 可能是间接作用，就是药物作用后细胞分泌某细胞因子，该细胞因子通过自分泌的方式作用于自己导致p-AKT上升。lingwu 谢谢战友！这种情况能不能就排除药物的直接作用？kern6549 当然只是猜测，想要明确当然需要你进一步研究了。本 ...

birkin 我在尝试转染某种细胞，载体是购买的商业载体（pCMV6)，之前转染HEK293作为预实验，已经用WB证明有效，但是换到现在这种细胞之后就很奇怪，一开始想用短期转，结果WB做不出来，觉得可能是转染率太低，于是又改做稳定转染，用了G418筛选。花了近2个月，细胞稳定下来了，取样做RT-PCR，有相当强的mRNA表达（-RT和对照组转染也做了的，基本没有带，所以不会是污染），谁知做WB还是一点东西都没有……我都快疯了 ...

hysong 配制PBST时必须要用分子级别的吗？如果用的吐温-20是普通的化学纯的会对结果有影响吗？woxingwosu 个人觉得应该影响不大吧。lijingxin198506 应该影响不大。rencuiping 配制PBST时所用试剂如：NaCl 、Na2HPO4、KH2PO4、KCl均应为分析纯，所用吐温-20是普通的化学纯不会对实验结果有影响，只是需要注意 吐温-20的浓度不同，洗涤效果不同。一般我们实验室用0.1%的。江边的麦 ...

mushuixiaotaozi 想找一下Western blot 做的比较好的公司xhjggl 可以买个试剂盒，自己做，这样可以增加实践机会，上海生工就有。flyeryeung http://protein.dxy.cn/bbs/topic/18102961看看这个丁香园战友写的总结吧，很有帮助。mushuixiaotaozi O(∩_∩)O谢谢啦mushuixiaotaozi O(∩_∩)O谢谢本文由丁香园论坛提供，想了解更多有用的、有意思的前沿资 ...

jingyue777 我最近做了变形链球菌超声提取上清蛋白的实验，离心后取上清，测定蛋白浓度为0.81mg/ml，我想请问有没有哪位做过类似的实验，如何判断超声破壁是否成功？一般提取的上清蛋白浓度为多少是正常的？谢谢woxingwosu 没有做过变形链球菌，只做过大肠杆菌的，不知道是不是一样的道理。在大肠杆菌中，只要超声到看起来超声液黏着（效果好可能会澄清）就算是可以。不过这个浓度是不是有点低？或者你的超声液加得比较多所 ...

已寒 我现在在做beta-catenin的western blot，用的是ABCAM的抗体,但是做出来的beta-catenin总是有两条条带，想请教一下各位，beta-catenin有分不同亚型么？或者有磷酸化或非磷酸化之分么？还是有别的原因？感激不尽！！zqm1115 请问你是在做干细胞相关研究吗？已寒 不是干细胞，是一株肿瘤细胞keavin521 不是高手， 说说我的看法1。 2个bands 出来也没关系， 在你要的分子量（85kd？)的地方的有 ...