【求助】gfp绿色荧光蛋白表达条件和方式
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本人将GFP基因后面加了一段大约110bp的序列，插入PET28A的BamH1和Hind3位点，最后在BL21中表达。
经SDS-PAGE验证表明：
目的蛋白 大量存在菌体裂解后沉淀即包涵体中，但是该沉淀无色。
少量存在于上清中，上清显微弱的绿色。
看文献大量报道GFP融合蛋白几乎都形成可溶性表达，目的蛋白在上清中，并且诱导条件没有太大要求。
想请教一下各位做过GFP原核表达的经验，本人应该怎么改进条件（本人用37度，5mM乳糖，诱导6小时），才能让GFP蛋白可溶性表达？或者包涵体复性的条件给些建议？谢谢大家了。
经SDS-PAGE验证表明：
目的蛋白 大量存在菌体裂解后沉淀即包涵体中，但是该沉淀无色。
少量存在于上清中，上清显微弱的绿色。
看文献大量报道GFP融合蛋白几乎都形成可溶性表达，目的蛋白在上清中，并且诱导条件没有太大要求。
想请教一下各位做过GFP原核表达的经验，本人应该怎么改进条件（本人用37度，5mM乳糖，诱导6小时），才能让GFP蛋白可溶性表达？或者包涵体复性的条件给些建议？谢谢大家了。
你的蛋白以包涵体形式出现gfp活性不行，因此看不见荧光应该可以理解。大量文献报道说gfp融合蛋白都可溶性表达并不能保证你的也是啊，肯定有不容的表达没有报道罢啦。一般应该是降低诱导温度，降低诱导剂浓度，但是也不是肯定管用，改变载体和宿主菌有时候也被采用。
非常感谢你的建议！希望大家多讨论一下给我点经验和建议，谢谢大家啦！
你好！要增加可溶性，可以换成为能增加可溶性表达的载体来试试，例如pGEX-4T-1或pET32a(+)等，如果还是不行，可能只能用真核表达系统啦！
kinguangjun wrote:
你好！要增加可溶性，可以换成为能增加可溶性表达的载体来试试，例如pGEX-4T-1或pET32a(+)等，如果还是不行，可能只能用真核表达系统啦！
可以在培养液中加10%蔗糖试试
诱导剂浓度降低，诱导温度降低，应该会好！
尽量获得可溶的，变复性就又麻烦了！
谢谢大家的意见，我已经降低温度了，用了30,28，23,18度诱导过夜，可是表达量都不高。不知道要是复性的话，是什么条件啊?
关键是可溶，表达不需要多高，多摇点菌就是了
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