1. 如果扩增曲线ct值比较靠后的话,32左右,一般有什么方法解决没有ct值比较靠后,对实验有一定的影响,因为经过那么多次的循环,酶的活性有可能有所下降,这时候扩增效率会有所改变(而定量PCR的理论基础就是每次循环的扩增效率我们认为是确定的一个值)。因此最好能够把ct值往前移。解决办法可以将模板加以浓缩或者抽干之后用少量水去溶解。2. 为什么合成的引物做不加摸板的对照也能扩增出目的条带,而内参用同样体系就没有呢?引物被 ...
一般来讲,进行real-time qPCR MasterMix都是2×的浓缩液,只需要加入模板和引物就可以。由于real-time qPCR灵敏度高,所以每个样品至少要做3个平行孔,以防在后面的数据分析中,由于Ct相差较多或者SD太大,无法进行统计分析。通常来讲,反应体系的引物终浓度为100-400mM;模板如果是总RNA一般是10ng-500,如果cDNA,通常情况下是1ul或者1ul的10倍稀释液,要根据目的基因的表达丰度 ...
qPCR的数据相对定量分析其实很简单。我做了很多的qPCR实验,也看了很多的资料,包括Nature protocol, AB官方的分析教程,MIQE,甚至包括一些商业化软件使用的教程及教程里面记述的原理。我在这里跟大家分享一下自己的经验,最常用,最普遍的相对定量方法就是2^-△△Ct法,该法最最简单的说就是:首先将一次实验的所有基因Ct值整理好,之后用每一组样本自身的目的基因Ct值减去自身内参基因Ct值,得到的数就是△Ct ...
基因表达的定义:每当说到基因表达,我自己都觉得不知所云,是指RNA,还是蛋白?是指mRNA还是包括风头正旺的非编码RNA?mRNA还有不翻译的RNA呢。应该说转录水平指的是RNA水平,而蛋白应该叫翻译水平?我们这里就特指编码蛋白的mRNA的量的检测。方法:很多很多,我们常用的也就是RT-PCR和northern(实际上我也只知道他们,丢人啊),但是RNA酶保护分析在国外很常用,也有半定量的功能,一次性试剂盒还能以此 ...
实时定量技术,是指在PCR体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃,而且与常规PCR相比,具有特异性强、自动化程度高等特点。因此已得到广泛应用。目前我们用的最多的就是SYBRGreenI(Molecular probes)和EvaGreenTM (BIOTIUM, USA) 这两种荧光染料。EvaGreen荧光染料与SYBRGr ...
问题1:无扩增产物现象:正对照有条带,而样品则无原因:1.模板:含有抑制物,含量低2.Buffer对样品不合适3.引物设计不当或者发生降解4.反应条件:退火温度太高,延伸时间太短对策:1.纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量2.更换Buffer或调整浓度3.重新设计引物(避免链间二聚体和链内二级结构)或者换一管新引物4.降低退火温度、延长延伸时间
RealTimePCR法是实时监测解析PCR扩增量的方法。因其无需电泳,大大减低了实验污染的机率,且具有快速、可对检测靶基因定量而倍受青睐。实时荧光定量PCR避免了传统PCR以终产物检测定量产生的偏差,提高实验的重复性。该技术已被广泛用于检测细胞、细菌等mRNA表达量的变化;比较不同组织的mRNA表达差异;验证基因芯片,siRNA干扰的实验结果。一、荧光定量技术服务需要的配套设备1、荧光定量PCR仪 ABI7900 ...
1.PCR芯片介绍实时定量PCR是检测基因表达最灵敏、最可靠的方法。通过在试验过程中,实时监测荧光染料的信号变化可反映出样品中的基因拷贝数,并且实时定量PCR线性范围广(能达到5个数量级),因此可以检测同一样品中表达量极低的基因和表达量很高的基因。但是,由于实时定量PCR需要制备标准曲线和同时分析内参基因,因而每次实验只能检测少数几个基因的表达水平,若要检测大量基因,则工作量巨大,耗时长久。通过简单的以及经过优 ...
其他方法也可以采用类拟的策略,以节约成本,提高效率。反应体系的建立及优化1. SG浓度:终浓度1:5,000-1:100,000,一般为1:10,000-1:70,0002. Primer浓度:终浓度50nM-300nM固定摸板浓度的梯度实验不加摸板的对照实验(NTC)--有无非特异信号熔解曲线的分析--是否单峰建议使用HPLC纯化的引物3. MgCl2浓度降低MgCl2浓度以减少非特异性产物最低可至1.5nM同时做梯度实验和NTC对 ...
沙滩上美妙的一天?Corona Del Mar这个典型的南加州海滩上美好的一天:晴朗的天空万里无云,蔚蓝而清澈的海水泛起层层海浪拍打着白色的沙滩。两位老人漫步在沙滩上,小孩子在他们前面嬉戏追逐着海鸥。今天的海水看起来那么清澈,沙滩上也没有竖起鲜红的指示牌或者黄色的隔离带警告人们远离被关闭的海滩。这样的景象并非总能看到。由此往北行驶一个半小时,在南加州海岸的另一个著名的地点,这个邻近Malibu Pier的区域最近被自然 ...
PCR检测微量感染因子时,容易因为污染的而导致各种问题,因此,进行PCR操作时,操作人员应该严格遵守一些操作规程,最大程度地降低可能出现的PCR污染或杜绝污染的出现。(1)划分操作区:目前,普通PCR尚不能做到单人单管,实现完全闭管操作,但无论是否能够达到单人单管,均要求实验操作在三个不同的区域内进行,PCR的前处理和后处理要在不同的隔离区内进行:① 标本处理区,包括扩增摸板的制备;②PCR扩增区,包括反应液的配制和PC ...
大家都知道进行绝对定量需要标准曲线,有些用户认为进行相对定量时就不需要标准曲线了,可以通过2哪C(t)来计算,但这一计算是有条件的,即所有荧光定量PCR扩增的效率都接近于100%,可以通过实验来证明。但大多数用户并没有进行这样的实验就直接用2哪C(t)来计算了。这是错误的,会得到错误结论。无论是使用自配的试剂还是用商业的荧光定量试剂盒,最好买够试剂,以免进行预实验或正式实验时没有试剂而必需采用其他试剂,由于不同试 ...
Single-cell RT-PCR单细胞RT-PCR技术创立于1991年,随着时间发展,其技术不断完善,在神经生物学、胚胎发育、免疫学等领域都有进一步发展。1.单细胞的获得第一步是获得单个完整的细胞,注意:快速精确操作,尽量减少在操作中由于外界刺激和时间过长引起的细胞表达上的改变,以及外源RNA和RNA酶的污染;目前常用方法有膜片钳技术,激光显微切割技术(LCM),显微吸管操作和流式细胞仪(FACS)。膜片钳技术是在单细 ...
一、引物设计中的几个注意事项1、 引物设计最好用相关的软件来进行设计,考虑引物自身回折、错配、引物二聚体、复性温度、产物变性温度等问题,其中产物的变性温度是大家不太关心的问题,但有些产物在一般的95度条件下不能充分解链,会严重影响实验结果。2、 引物所设计的片断一定要有足够的特异性,选择好片段后,最好到互联网中进行相关的搜索,看在样本的基因组有没有相拟的基因以及假基因等,如果有,则可选择特异性更高的区域。3、 在进行mRNA表 ...
选择单通道实验还是多通道实验?这是要根据实验需要来选择的,如果有一个、两个或是三个基因要进行比较,并用看家基因进行对照,可以考虑选择多通道实验。多通道实验的好处是可以消除样本加样的误差。但要克服的困难也比较多,一是条件的优化比较麻烦,即多种PCR反应以及探针要在同一个反应条件下进行,并且效率都要比较高,另一个困难是要求相互之间没有干扰,因为干扰会影响到实验结果。还有一个困难是当一个基因的模板数显著大于其他基因时 ...
前一段时间在百度中搜索,发现多年前写的一个关于荧光定量PCR技术的PPT有很多人看过或引用过,考虑到自己作荧光定量PCR工作已经了五年了,做的实验以及解决的问题远比五年前多了,因此利用过年的时间,写点荧光定量PCR实验中的一些注意事项及感想,无论对错,都是希望对相关的人员有些参考价值。荧光定量PCR原理等大家都已经很熟了,我就不细说了,主要是写一些有人问过的事,希望写的内容是大家都关心的。普通PCR与荧光定量 ...
一、目的基因的获得 目的基因是指所要研究或应用的基因,也就是将要克隆或表达的基因。获得目的基因是分子克隆过程中最重要的一步。目前用于获得目的基因的方法有几种,如限制性内切酶直接分离法、文库筛选法、体外扩增法和人工合成法等,其中限制性内切酶法直接分离目的基因和多聚酶链式反应(PCR)或逆转录-多聚酶链式反应(RT-PCR)体外扩增目的DNA片段是目前最常用的方法。 (一)采用限制性酶切法直接分离目的基因 1. 从原核基因组中制备 原核 ...
一、核酸探针标记 核酸探针分子杂交是指具有一定同源性的两条核酸单链在一定条件下(适宜的温度及离子强度等)可按碱基互补原则形成双链,此杂交过程是高度特异的。杂交的双方是待测核酸及探针。 核酸探针根据核酸的性质,可分为DNA和RNA探针;根据标记物不同,可分为放射性标记探针和非放射性标记探针两大类;根据是否存在互补链,可分为单链和双链探针;根据放射性标记物掺入情况,可分为均匀标记和末端标记探针。下面主要介绍双链DNA探针及 ...
多聚酶链式反应即PCR(polymerase chain reaction)技术,应用这一技术可以将微量目的基因(DNA片段)扩增一百万倍以上。PCR反应理论的提出和技术的完善对于分子生物学的发展具有特殊的意义,它以敏感度高、特异性强、产率高、重复性好以及快速简便等优点迅速成为分子生物学研究中应用最为广泛的方法之一,并使得很多以往无法解决的分子生物学研究难题得以解决。发明这一技术的K. Mullis因此贡献而获得了199 ...
RNA纯化和分析:起始RNA样品的质量是成功实验的最重要的因素之一。我强烈推荐使用QIAGEN的RNA纯化试剂盒来进行RNA纯化。RNA样品必须进行柱上DNase处理,以保证你的RNA的纯度。假如你的样品很特别,需要选择一个最合适的试剂盒进行纯化,请致电或e-mail联系QIAGEN技术人员,他们很乐意帮您选择一个合适的试剂盒。确保RNA样品适合进行PCR array。RNA样品进行PCR array实验前必须先通 ...