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        PCR常见问题分析及对策

        天津百萤

        3633

        问题1:无扩增产物

        现象:正对照有条带,而样品则无

        原因:

        1.模板:含有抑制物,含量低
        2.Buffer对样品不合适
        3.引物设计不当或者发生降解
        4.反应条件:退火温度太高,延伸时间太短
        对策:1.纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量
        2.更换Buffer或调整浓度
        3.重新设计引物(避免链间二聚体和链内二级结构)或者换一管新引物
        4.降低退火温度、延长延伸时间

        问题2:非特异性扩增

        现象:条带与预计的大小不一致或者非特异性扩增带

        原因:

        1.引物特异性差
        2.模板或引物浓度过高
        3.酶量过多
        4.Mg2+浓度偏高
        5.退火温度偏低
        6.循环次数过多

        对策:

        1.重新设计引物或者使用巢式PCR
        2.适当降低模板或引物浓度
        3.适当减少酶量
        4.降低镁离子浓度
        5.适当提高退火温度或使用二阶段温度法
        6.减少循环次数

        问题3:拖尾

        现象:产物在凝胶上呈Smear状态

        原因:

        1.模板不纯
        2.Buffer不合适
        3.退火温度偏低
        4.酶量过多
        5.dNTP、Mg 2+浓度偏高
        6.循环次数过多
        对策:1.纯化模板
        2.更换Buffer
        3.适当提高退火温度
        4.适量用酶
        5.适当降低dNTP和镁离子的浓度
        6.减少循环次数

        问题4:假阳性

        现象:空白对照出现目的扩增产物

        原因:靶序列或扩增产物的交叉污染

        对策:

        1.操作时应小心轻柔,防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外
        2.除酶及不能耐高温的物质外,所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及加样枪头等均应一次性使用
        3.各种试剂最好先进行分装,然后低温贮存。



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