qPCR（RT-PCR）数据相对定量的分析方法与经验
&丁香园
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qPCR的数据相对定量分析其实很简单。我做了很多的qPCR实验，也看了很多的资料，包括Nature protocol， AB官方的分析教程，MIQE，甚至包括一些商业化软件使用的教程及教程里面记述的原理。
我在这里跟大家分享一下自己的经验，最常用，最普遍的相对定量方法就是2^-△△Ct法，该法最最简单的说就是：
首先将一次实验的所有基因Ct值整理好，之后用每一组样本自身的目的基因Ct值减去自身内参基因Ct值，得到的数就是△Ct；换成公式就是：△Ct=Ct（目的基因）-Ct（内参基因）；
然后，将每一组样本每一个目的基因的△Ct都算好，整理进Excel，用本次实验中待研究样本的△Ct减去对照组样本的△Ct，并同时对所有结果取相反数（就是加一个负运算，正数就变成负数，负数就变成正数），该步运算得到的结果就是-△△Ct。
最后，对-△△Ct进行2的幂运算，即2^-△△Ct就得出Fold Change。
但是，我想说的是2^-△△Ct得出的是Fold Change，不仅数据结果看上去不直观反应实验组与对照组目的基因mRNA的情况，同时还具有放大效应，所谓放大就是本来A基因的-△△Ct得到为2，B基因-△△Ct为4，两者相差2，经过2的幂运算之后，A基因为4，B基因为16，两者相差12！
• 相对定量本身就存在放大的情况，若是再采取2^-△△Ct就只能说看看趋势而已了，所以我在这里给大家推荐ABi官方的一个分析方法，就是log2R，就是log2为底对R求对数。当相对定量分析时，默认扩增效率E趋近或等于100%，这时候R就是2^-△△Ct，当然原本的R的公式我会在后面附上，感兴趣的朋友可以自己去推导。
所以，我用的方法就是只计算到-△△Ct这一步就够了，这样得到的数据就有了正值与负值，正值表示较对照组mRNA上调，负值表示较对照组mRNA下调，作出图来非常直观，一目了然，也没有放大效应，显著性分析较为靠谱。这种运算方法最关键的在于负号以及实验组和对照组要分清楚！要不就得到相反的结果。
附上R的完整公式： R=(1+E1)^△Ct1(Control-Sample)/(1+E2)^△Ct2(Control-Sample)
其中，E1：目的基因引物扩增效率；E2：内参基因引物扩增效率；△Ct1：实验组目的基因Ct值差；△Ct2：对照组目的基因Ct值差。 你观察这个公式时候就发现，当扩增效率E为1（即100%）时，该公式就等于2^-△△Ct，这就是为什么会有2^-△△Ct方法的原因！！！ ABi官网里的一款商业软件能直接给出每次试验每对引物的扩增效率E，能得到较为实际的R值，所以ABi的商业软件会对R进行log2的运算，进而得到直观的结果。
