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        荧光定量PCR详细流程和问题解析

        丁香园

        3004

        选择单通道实验还是多通道实验?

        这是要根据实验需要来选择的,如果有一个、两个或是三个基因要进行比较,并用看家基因进行对照,可以考虑选择多通道实验。多通道实验的好处是可以消除样本加样的误差。

        但要克服的困难也比较多,一是条件的优化比较麻烦,即多种PCR反应以及探针要在同一个反应条件下进行,并且效率都要比较高,另一个困难是要求相互之间没有干扰,因为干扰会影响到实验结果。

        还有一个困难是当一个基因的模板数显著大于其他基因时,因为共用核苷酸等资源的原因,会让模板数少的基因的定量值变小或变为零。因此一般两通道的实验比较多些,即一个基因进行多样本比较,用看家基因进行对照。

        可以看出,如果单通道实验可以解决问题,就不要选择多通道实验了。三个以上的基因进行比较时就最好用单通道。因为一般的仪器最多也只有四个通道,就是有更多的通道,实验条件的优化也是足够麻烦了。

        双通道实验时如何克服反应条件、干扰以及模板数差别很大等困难?

        对于反应条件的优化,可通过两个单独实验的标准曲线来优化,主要是复性温度,可用PCR仪的温度梯度功能来选择,然后找到一个合适的复性温度。对于如何确定是否存在相互干扰,则要通过两个独立的单通道实验与双通道实验的结果进行比较,如果差别不大,则表明没有干扰。

        至于模板数差别很大的问题,可以通过降低引物浓度的方法来实现,即primer limited,在一般的PCR反应中,引物的浓度是足够高的,基本上可以将反应液中的核苷酸全部消耗尽,在优化引物浓度时,用不同的引物浓度进行实验,找到不影响反应的CPhone值的最低引物浓度。

        这样在实际反应中,模板数高的基因在引物耗尽后,反应液中仍然有足够的核苷酸等用于另一个基因的反应。


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