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        荧光定量PCR详细流程和问题解析(五)

        丁香园

        4242

        其他方法也可以采用类拟的策略,以节约成本,提高效率。

        反应体系的建立及优化

        1. SG浓度

        终浓度1:5,000-1:100,000,一般为1:10,000-1:70,000

        2. Primer浓度

        终浓度50nM-300nM

        固定摸板浓度的梯度实验

        不加摸板的对照实验(NTC)--有无非特异信号

        熔解曲线的分析--是否单峰

        建议使用HPLC纯化的引物

        3. MgCl2浓度

        降低MgCl2浓度以减少非特异性产物

        最低可至1.5nM

        同时做梯度实验和NTC对照

        4. 反应温度和时间参数

        反应温度参考所用酶的种类

        退火温度使用温度梯度功能优化

        反应时间与常规PCR类似,扩增片断一般为200-300bp


        5. TaqMan探针

        引物、探针设计:

        首先选择探针序列

        探针的Tm值为68-70度,长度不应超过30碱基

        探针的5’端不应是G,G有可能会淬灭荧光素

        引物应尽量靠近探针,扩增片断不超过400bp,通常为80-150bp

        引物的Tm值为59-60度,长度约20碱基

        避免引物、探针之间的二级结构

        委托合成公司设计

        使用辅助软件

        确定反应参数

        一般为两步法,94度10-20s

        60度30-60s (Taq酶的5’外切酶活性在60度最强)

        通过温度梯度优化退火温度

        三步法, 72度45s

        优化引物探针浓度

        目标:最高的信号/背景比

        最小的Ct值

        引物浓度:50nM-900nM

        探针浓度:50nM-250nM

        通过多次实验确定各自的浓度和比例

        感谢站友 arsen <http://i.dxy.cn/profile/arsen>   原文详见 http://www.dxy.cn/bbs/topic/14559458
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