PCR技术

一、细胞裂解的准备(1)1×107 细胞重悬, 其来源可为新鲜样品或贮存于- 80℃ 1mo l 冰冻清洗缓冲液中的无DM SO 的样品, 冰冻缓冲液包括10mM HEPES (pH7. 5), 1. 5mM M gCl2, 10mM KCl,1mM 二硫苏糖醇(DTT ) , 然后离心(16 000rpm、4℃、1m in)。(2)重悬细胞团于100ul 冰冻裂解缓冲液, 其包含10mM T ris-HCl (pH7. 5) , 1mM MgCl2, 1mM EGTA , 0. 1mM 苯甲基磺酰氟(DMSF ) , 5mM B2巯基乙醇, 0. 5% CHA P s(Pierce) 和10% 甘油。(3)冰育30 分, 然后在超速离心机 ...

需准备的材料及试剂：1、DEPC水处理的EP管（1.5ml，1.0ml），Tip头2、玻璃平皿、镊子180℃烘烤6小时，以祛除RNA酶3、硝酸纤维素膜4、DigRNA labeling kit（sp6/T7）5、经分离纯化的线形模板DNA6、DEPC水处理过的无RNase 的0.2M EDTA，PH=8.07、RNA稀释用Buffer8、BufferⅠ9、BufferⅡ10、50×blocking11、Detection12、Dig 抗体及显色底物 ...

测序结果常见的几个问题 1 、 为什么开始一段序列的信号很杂乱，几乎难以辨别?这主要是因为残存的染料单体造成的干扰峰所致，该干扰峰和正常序列峰重叠在一起；另外，测序电泳开始阶段电压有一个稳定期，所以经常有20-50 bp 的紧接着引物的片段读不清楚，有时甚至更长。2 、 为什么在序列的末端容易产生 N 值，峰图较杂?由于测序反应的信号是逐渐减弱的，所以序列末端的信号会很弱，峰图自然就会杂乱，加上测序胶的分辨率问题，如果碱基分不开，就会产生 N 值，正常情况 ...

大肠杆菌克隆转化作为分子生物学的基础之一，具有广泛的应用性。并且，随着新技术的发展，大肠杆菌克隆转化操作变得比以前更加简单易行。下面，我将以结合自己研究生对于这个体系操作的经验，对于现行的大肠杆菌操作体系进行一定的优化，希望能够给大家节省克隆转化的时间以及提高成功率。一般来说，克隆转化从开始到结束分为获取基因，设计引物，PCR基因，酶切，连接，转化，菌落PCR以及挑取克隆酶切验证几个步骤。下面我将根据时间顺序，对每 ...

以下每一个试剂盒都有实验步骤，操作说明及结果图片等，3年反复实验的成果。因JPG, GIF, PNG 图片过大，不能上传，如有需要请发邮箱dushengbiotech@163.com，说明需求，即有回复，欢迎技术讨论及咨询。1、Nova Taq DNA Polymerase（聚合酶）2、Nova Pfu DNA Polymerase3、Nova Kod DNA Polymerase4、Nova Extra-Kod DNA Polymerase5、Nova Tth DNA Polymera ...

PCR产物的电泳检测时间　　一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消失。假阴性，不出现扩增条带　　PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及，④PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。　　模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq 敢种 剂，③模板中蛋白质?有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。⑤模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时， ...

上游引物 5’－GGAA CCAGTTCGTC CCCAGCCAA -3’下游引物 5-CACCAAAGTCCCAGGAGGCCG-31 cggcctcaac aacgtccctt actccgccaa gagcagctat gacctgggct acaccgccgc61 ctacacctcc tacgctccct atggaaccag ttcgtcccca gccaacaacg agcctgagaa121 ggaggacctt gagcctgaaa ttcggatagt gaacg ...

Homo sapiens v-my... LinksLOCUS NM_005378 2458 bp mRNA linear PRI 21-DEC-2003DEFINITION Homo sapiens v-myc myelocytomatosis viral related oncogene,neuroblastoma derived (avian) (MYCN), mRNA.ACCESSION NM_005378VERSION NM_005378.3 GI:34147496ORIGIN1 ctccggtgtg t ...

实时荧光PCR作为新一代分子生物学研究工具，已成为分子诊断、临床检验以及基础生物医学研究的主流技术平台，广泛应用于传染病、肿瘤、遗传病、心血管等疾病的分子诊断。为使广大一线工作人员全面掌握该技术，本中心在连续举办四届荧光PCR研讨会并获广泛好评的基础上，再次携手国内外荧光PCR领域的知名专家，于2012年12月2-8日举办“第五届荧光PCR与分子诊断研讨会” 。本届研讨会将继续采用深受好评的技术讲座与现场实验相结 ...

PCR问题及解决内容：Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 292Developing a PCR Strategy: The Project Stage . . . . . . . . . . . . . 293Assess Your Needs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 293Identify Any Weak Links in Your PCR Strategy . . . . . . . . . . 295Manipulate the Reaction to Meet Your Needs . . . . . . . . . . 296Developing a PCR Strategy: The Experimental Stage . . . . . . . 296What Are the Practical Cr

质粒提取原理（别人的总结）碱法质粒抽提用到三种溶液：溶液I，50 mM葡萄糖 /25 mM Tris-Cl / 10 mM EDTA，pH 8.0；溶液II，0.2 N NaOH / 1% SDS；溶液III，3M 醋酸钾 / 2 M 醋酸。让我们先来看看溶液I的作用。任何生物化学反应，首先要控制好溶液的pH，因此用适当浓度的和适当pH值的Tris-Cl溶液，是再自然不过的了。那么50 mM葡萄糖是干什么的呢？说起来不可思议，加了葡萄糖后最大的好处只是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。因此， ...

Primer designThe gene of interest usually has to be amplified from genomic or vector DNA by PCR (polymerase chain reaction) before it can be cloned into an expression vector. The first step is the design of the necessary primers.Important features are:Primer sequence. Especially the 3'-end of t ...

我需要设计引物,将两条片段用45bp的linker连起来, 并且在片段2的3’端加上30个bp 的tag和两个酶切位点,我已经被困惑了很长时间,希望有高手帮帮忙,非常感谢!片段1:5’ACCATGGCTGTCTTGGGGCTGCTCTTCTGCCTGGTGACATTCCCAAGCTGTGTCCTATCCCAGGTGCAGCTGAAGCAGTCAGGACCTGGCCTAGTGCAGCCCTCACAGAGCCTGTC ...

我是一名新手，最近准备做一项RT-PCR检测小鼠脾组织含某种病毒的工作，刚接触分子生物学，在丁香园上看了诸多帖子，感觉是受益非多。但由于没有实践，很多东西仅停留在感性认识，有些还不怎么懂，希望得到前辈的帮助。1.脾组织的磨碎：我询问并参观了学校的有关老师的做法：在用Triol提的时候，是把脾组织称取50mg放入1.5ml离心管内，加入提取液后，然后用眼科剪剪碎，之后用手拿离心管按在磁力涡旋混匀器打悬，由于剪刀一下很 ...

拟扩增408位至3533位，插入真核表达载体pCAGGS扩增，请高手帮忙设计引物，指点一下不胜感激！1 agaagtttat ctgtgtgaac ttcttggctt agtatcgttg agaagaatcg agagattagt61 gcagtttaaa cagtttttta gaacggaaga taaccatgac taaaaaacca ggagggcccg121 gtaaaaaccg ggctatcaat atgctgaaac gcggcctacc ccg ...

过去的几年里人群中肥胖症患者的比例急剧升高。因此对脂肪细胞---脂肪组织的基本组成单位---功能的研究也不断升温。这其中大多数的研究通过从脂肪组织中提取少量的RNA来检测参与代谢调控的低丰度基因表达水平。就小量RNA的检测而言，与传统的RNA定量检测手段（如RNA印迹分析）相比，逆转录实时定量PCR(qRT-PCR)更为灵敏。实际上，这一技术足以定量单细胞的RNA水平。qRT-PCR应用的主要限制因素是结果的高不稳定 ...

准备用RT-PCR扩Sema3b（NM_004636） .1 gggcgggggc tgcttcttaa aggagccgtc agagggtccc cagcggcccc agggtgggaa61 ggggccagag tggagagatg ctgctgcgga agtcctcggt ggagtgtgag aaggcagcca121 gtgttggcct ggaagacctc tagaacctga gaagaggcag cgatcctggg gcagagtcca181 gggca ...

我在克隆一个基因，以前的师姐做出来了，由于找不到原来的引物，我又重新设计，前后设计了两引物，用primer5检测都很好，就是P不出来，请各位高手指教，究竟哪里出了问题。附上我的基因mRNA及我所设计的引物，反应参数等条件。mRNA序列：其中CDS在315－5871 ctgcgcagat gaggggagac tcgtcaccag gcgtgcagtg ggcactgctg ggctccccca61 tcccgtccta acccggaaca g ...

PCR常见问题总结PCR产物的电泳检测时间一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消失。一.假阴性，不出现扩增条带　　PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及活性 ④PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。　　模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。⑤模板核 ...

RACE使用对象http://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/2785112_0.htmlRACE原理http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=64&id=1342728&sty=3&keywords=RACEhttp://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/806243_0.htmlhttp://www.dxy.cn/bbs/thread ...