非放射性荧光TRA P 法对端粒酶活性的检测与定量
丁香园论坛
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一、细胞裂解的准备
(1)1×107 细胞重悬, 其来源可为新鲜样品或贮存于- 80℃ 1mo l 冰冻清洗缓冲液中
的无DM SO 的样品, 冰冻缓冲液包括10mM HEPES (pH7. 5), 1. 5mM M gCl2, 10mM KCl,
1mM 二硫苏糖醇(DTT ) , 然后离心(16 000rpm、4℃、1m in)。
(2)重悬细胞团于100ul 冰冻裂解缓冲液, 其包含10mM T ris-HCl (pH7. 5) , 1mM MgCl2, 1mM EGTA , 0. 1mM 苯甲基磺酰氟(DMSF ) , 5mM B2巯基乙醇, 0. 5% CHA P s(Pierce) 和10% 甘油。
(3)冰育30 分, 然后在超速离心机中离心30 分钟。
(4)去上清, 液氮速冻沉淀, 裂解细胞于-80℃保存。
二、扩增
(1)在微量管中冻干0. 1ug 荧光标记的cx反转引物, 蜡封(5′CCC TTA CCC TTA CCC
TTA CCC TTA 3′)。
(2)于蜡界之上加50ul TRA P 反应物, 包括T ris-Cl (pH8. 3) 20mM , 1. 5mM MgCl2,
63mM KCl, 0. 005% , TWeen20, 1mM EGTA , 50mM 三磷酸脱氧核苷, 0. 1ug 荧光标记
TS 前导引物(5′AA T CCG TCG A GC A GAGTT 3′) , 1ug T 4 基因32 蛋白, 牛血清白蛋白0. 1m g/m l, 2U Taq NDA 聚合酶(Takara,shyzou) 和5ug CHAPs 细胞提取液。荧光标记TS 引物可由市场购得。扩增前5ug 提取物与1ug RNA 酶37℃水浴20 分钟, 为了端粒酶活性的标准化, 运用体内端粒酶活性标准(TTAS) : TS 重叠引物和CX 重叠引物(TS:5′AA T CCG TCG A GC A GA GTT GTG AA T GA G GCC TTC 3′及CX: 5′CCC TTA CCC TTA CCCTTA CCCTTA TA GGCG CTC AA T GTA 3′) TS (18bp ) 和CX (24bp )序列为普通型, 下划线标出的为成肌素序列(每个15bp )。成肌素cDNA 通过这些引物扩
增产生了150bp 的产物, 它可用与ITAS 扩增端粒酶梯度相同的TS 引物和CX 引物进行
再扩增。每一项测定用25attogram 以显现I-TA S, 它并不干扰TRA P 测量。
(3)置于22℃ 10 分钟, 作为TS 引物由端粒酶介导的延伸。90℃热灭活反应物90 秒。
(4)PCR 扩增, 条件94℃30S, 50℃ 30S,72℃1. 5m in; 共27 循环。
三、分析
(1)制备8% 的变性胶( long Ranger ,ATB iochem ) 含6M 尿素。
(2)加电泳缓冲液(1×TBE) 于电泳槽。
(3)上样缓冲液与产物各1ul 混合后上样, 上样缓冲液含90% 甲酰胺和10% 蓝葡聚
糖(B lue dert ian)。
(4)95℃预发性4 分钟, 速冷, 上样, 运用100bp , 150bp , 200bp 大小荧光标记物。
(5)测序
(6)测序结果由Fiagmunt Manager 程序自动分析, 每一荧光峰根据大小、高度、面积定
量。因为过量扩增的产物会产生不可信的面积值, 一部分PCR 产物应在蒸馏水稀释后再分析
(1)1×107 细胞重悬, 其来源可为新鲜样品或贮存于- 80℃ 1mo l 冰冻清洗缓冲液中
的无DM SO 的样品, 冰冻缓冲液包括10mM HEPES (pH7. 5), 1. 5mM M gCl2, 10mM KCl,
1mM 二硫苏糖醇(DTT ) , 然后离心(16 000rpm、4℃、1m in)。
(2)重悬细胞团于100ul 冰冻裂解缓冲液, 其包含10mM T ris-HCl (pH7. 5) , 1mM MgCl2, 1mM EGTA , 0. 1mM 苯甲基磺酰氟(DMSF ) , 5mM B2巯基乙醇, 0. 5% CHA P s(Pierce) 和10% 甘油。
(3)冰育30 分, 然后在超速离心机中离心30 分钟。
(4)去上清, 液氮速冻沉淀, 裂解细胞于-80℃保存。
二、扩增
(1)在微量管中冻干0. 1ug 荧光标记的cx反转引物, 蜡封(5′CCC TTA CCC TTA CCC
TTA CCC TTA 3′)。
(2)于蜡界之上加50ul TRA P 反应物, 包括T ris-Cl (pH8. 3) 20mM , 1. 5mM MgCl2,
63mM KCl, 0. 005% , TWeen20, 1mM EGTA , 50mM 三磷酸脱氧核苷, 0. 1ug 荧光标记
TS 前导引物(5′AA T CCG TCG A GC A GAGTT 3′) , 1ug T 4 基因32 蛋白, 牛血清白蛋白0. 1m g/m l, 2U Taq NDA 聚合酶(Takara,shyzou) 和5ug CHAPs 细胞提取液。荧光标记TS 引物可由市场购得。扩增前5ug 提取物与1ug RNA 酶37℃水浴20 分钟, 为了端粒酶活性的标准化, 运用体内端粒酶活性标准(TTAS) : TS 重叠引物和CX 重叠引物(TS:5′AA T CCG TCG A GC A GA GTT GTG AA T GA G GCC TTC 3′及CX: 5′CCC TTA CCC TTA CCCTTA CCCTTA TA GGCG CTC AA T GTA 3′) TS (18bp ) 和CX (24bp )序列为普通型, 下划线标出的为成肌素序列(每个15bp )。成肌素cDNA 通过这些引物扩
增产生了150bp 的产物, 它可用与ITAS 扩增端粒酶梯度相同的TS 引物和CX 引物进行
再扩增。每一项测定用25attogram 以显现I-TA S, 它并不干扰TRA P 测量。
(3)置于22℃ 10 分钟, 作为TS 引物由端粒酶介导的延伸。90℃热灭活反应物90 秒。
(4)PCR 扩增, 条件94℃30S, 50℃ 30S,72℃1. 5m in; 共27 循环。
三、分析
(1)制备8% 的变性胶( long Ranger ,ATB iochem ) 含6M 尿素。
(2)加电泳缓冲液(1×TBE) 于电泳槽。
(3)上样缓冲液与产物各1ul 混合后上样, 上样缓冲液含90% 甲酰胺和10% 蓝葡聚
糖(B lue dert ian)。
(4)95℃预发性4 分钟, 速冷, 上样, 运用100bp , 150bp , 200bp 大小荧光标记物。
(5)测序
(6)测序结果由Fiagmunt Manager 程序自动分析, 每一荧光峰根据大小、高度、面积定
量。因为过量扩增的产物会产生不可信的面积值, 一部分PCR 产物应在蒸馏水稀释后再分析
