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        太郁了,怎么都出不来,请大家分析分析

        丁香园论坛

        782
        我在克隆一个基因,以前的师姐做出来了,由于找不到原来的引物,我又重新设计,前后设计了两引物,用primer5检测都很好,就是P不出来,请各位高手指教,究竟哪里出了问题。
        附上我的基因mRNA及我所设计的引物,反应参数等条件。
        mRNA序列:其中CDS在315-587
        1 ctgcgcagat gaggggagac tcgtcaccag gcgtgcagtg ggcactgctg ggctccccca
        61 tcccgtccta acccggaaca gccccgggca ggaggcgtgg aaagtcgagg gggtaaaccg
        121 cgaatgtgcg ttgtgtaagc cacggcgcag ggtggggcgc gggcgggact tgggcgggcg
        181 gggtgggctt ggccgagctg gcctccgggg caccgaccgc tataaggcca gtcggactgc
        241 gacacagccc atcccctcga ccgctcgcgt cgcatttggc cgcctcccta ccgctccaag
        301 cccagccctc agccatggca tgccccctgg atcaggccat tggcctcctc gtggccatct
        361 tccacaagta ctccggcagg gagggtgaca agcacaccct gagcaagaag gagctgaagg
        421 agctgatcca gaaggagctc accattggct cgaagctgca ggatgctgaa attgcaaggc
        481 tgatggaaga cttggaccgg aacaaggacc aggaggtgaa cttccaggag tatgtcacct
        541 tcctgggggc cttggctttg atctacaatg aagccctcaa gggctgaaaa taaataggga
        601 agatggagac accctctggg ggtcctctct gagtcaaatc cagtggtggg taattgtaca
        661 ataaattttt tttggtcaaa ttt
        引物:
        1 sense   121  5' CGAATGTGCGTTGTGTAAGC 3'
        2 anti    654  3' GTTTAGGTCACCACCCATTA 5'
        其中:121  20bp Tm57.5 GC% 50
        654 20bp Tm 54.7 GC% 45
        反应参数:P1 1ul
        P2 1ul
        template 2ul
        undefinedmaster 10ul
        ddH20 6ul
        反应条件:95 5min
        95 30S
        50 30S
        72 1min
        共30次
            72 10min
        其中退火温度试过了47、50均未出结果。不知该如何?
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