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        RNA探针标记Protocol

        丁香园论坛

        3559
        需准备的材料及试剂:1、DEPC水处理的EP管(1.5ml,1.0ml),Tip头
        2、玻璃平皿、镊子180℃烘烤6小时,以祛除RNA酶
        3、硝酸纤维素膜
        4、DigRNA labeling kit(sp6/T7)
        5、经分离纯化的线形模板DNA
        6、DEPC水处理过的无RNase 的0.2M EDTA,PH=8.0
        7、RNA稀释用Buffer
        8、BufferⅠ
        9、BufferⅡ
        10、50×blocking
        11、Detection
        12、Dig 抗体及显色底物(NBT/BCIP)

        RNA探针的标记反应
        1、取1μg纯化模板DNA,加入无菌、无RNase的EP管中,以DEPC水补齐体积至6.5μl
        2、在冰上加入下述试剂
        10×NTP labelig mixture 7 1μl
        10×Transcription buffer 8 1μl
        Rnase inhibator 10 0.5μl
        RNA polymerase SP6 11 1μl
        or
        RNA polymerase T7 12 1μl
        轻轻混匀,短暂离心
        37℃孵育2小时——过夜
        3、向上述反应体系中加入2μlDnase(Rnase free)以祛除模板DNA
        37℃孵育2小时
        4、2μl 0.2M EDTA终止反应

        探针浓度的检测
        1、稀释:分别以RNA稀释用Buffer稀释RNA探针及controlRNA labeled
        探针倍比稀释 1:10 1:100 1:500 1:1000 1:5000 1:10000
        control RNA labeled 倍比稀释
        1:10 1:100 1:500 1:1000 1:5000 1:10000 1:100000 1:1000000
        2、点膜:T7、SP6方向探针及control 各点一排
        剪掉膜的一角以做标记
        按照浓度由低到高依次点膜
        3、紫外交连,2min
        4、BufferⅠwash ,2min
        Buffer Ⅱ wash ,15min
        5、抗体反应:1)包被:1×blocking,30min (blocking以BufferⅠ稀释)
        2)加抗体反应,30min,37℃(抗体浓度1:5000,以1×blocking稀释)
        6、BufferⅡ wash,5min×2
        7、Detection,2min
        8、呈色,暗处过夜:显色剂NBT/BCIP:Detection = 1:50
        9、显色后用水冲洗干净,干燥后扫描保留结果
        显色后一定要先用水冲洗以终止反应,在做扫描,否则光线照射将增高背底。
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