【原创】大肠杆菌分子克隆优化经验
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大肠杆菌克隆转化作为分子生物学的基础之一，具有广泛的应用性。并且，随着新技术的发展，大肠杆菌克隆转化操作变得比以前更加简单易行。下面，我将以结合自己研究生对于这个体系操作的经验，对于现行的大肠杆菌操作体系进行一定的优化，希望能够给大家节省克隆转化的时间以及提高成功率。
一般来说，克隆转化从开始到结束分为获取基因，设计引物，PCR基因，酶切，连接，转化，菌落PCR以及挑取克隆酶切验证几个步骤。下面我将根据时间顺序，对每一个部分进行说明以及优化。
1获取基因，获取基因的方式有以下几种：提取质粒，提取基因组，mRNA逆转录。
我在研究生阶段只是涉及了前面两种比较常用的方式。其中，提取质粒建议使用omega或者maxgen这两种试剂盒进行提取。操作步骤按照说明书即可。
其中质粒提取，需要注意的点为
1 不宜加入过多的菌体，平均一个EP管最多加入2ml OD=3的离心菌体。最好是加入OD=2就可以了。OD不需要事先去测量，大致上通过肉眼估计一下即可。一般来讲2-4mlOD=2的菌体就足够你获得很浓的质粒了（假如是PET28a这种就需要多加一点，一般使用20ml。因为一个细胞内只有10多个质粒，不像克隆载体有500个左右）
2加入溶液I之后要混匀，不要有残留的菌体粘在壁上。可以通过吹打，或者通过震荡的方式来实现混匀（大量处理组的时候）
3 加入溶液II之后混匀，上下颠倒10次即可。通过两个96孔放置EP管的板子夹住中间EP管便可方便操作完成此步骤。假如操作结束后，发现溶液变得很清亮，表示你的裂解效果很好，假如仍然浑浊，不建议继续操作，应该查看是否为杂菌以及是否需要添加溶菌酶等手段对细菌进行处理。
4 加入溶液III之后一定要混匀，随意混就可以了，上下颠倒5次。
5 之后的10min离心最烦恼的。现在maxgen试剂盒开发的质粒提取试剂盒只需要离心1min，能够节省这一部分的时间。
6 之后的上样于硅胶柱的时候，直接打开EP管，将上清倒入硅胶柱即可，节省枪头以及时间。调整转速为10000转1min即可，最后一次洗脱乙醇的时候14000rpm 3min即可，不需要之后对硅胶柱进行烘干或者用风筒吹，效果一样非常棒。
7 若想提高质粒的溶解效果，可以使用65度的dd水来溶解，建议都用水，不要用它给的solution来溶解，因为其中有盐，有的时候会对下游实验造成一定的干扰，比如说，你要进行电转什么的，其实两种buffer取得的结果都是不错的。
8最后在回收的质粒EP管上写上质粒的名称，日期以及操作人，养成良好习惯。因为我们的记忆实在不敢恭维，一定会忘记的。
而对于提取基因组来说，建议使用omega公司的bacteriaDNA kit效果蛮不错的，对于提革兰氏阳性细菌如枯草芽孢杆菌来说，只需要添加溶菌酶（加入2mg/ml效果最好，过多了会形成粉笔灰状的沉淀）以及蛋白酶K即可，非常方便，其他的无什么需要注意的地方，结合以上质粒提取的注意事项便能够获得良好的提取效果。
在提取DNA之后，一般需要进行跑胶鉴定，其中胶孔上面如果出现很亮的部分，是样品中残余的蛋白，而加入在低分子量区域有很亮的部分，是没有去除的RNA部分，可以根据自己的问题进行后续处理，比如加一下RNA酶这类的。
另外，提取出来的质粒一般具有2-3条带，原因是因为质粒分子构型不同以及质粒自身进行寡聚所致，因而对于质粒的分子量大小，不能以跑质粒的大小来鉴定，需要酶切鉴定。
2 设计引物
设计引物是困扰了很多初学者的难题，经常会有人相信公司设计的引物，而怀疑自己的能力，其实引物设计是一个必须要掌握的技能，也是很好掌握的技能。
在开头，必须强调一个原则，引物设计只有挑选最好的，而没有满分的选项，不要求全责备。不要经常去抱怨或者担心，会不会P不出来啊，这种问题，实践出真知。
首先我们说说引物序列的构成，从5-3端，分别是保护碱基 酶切位点 以及同源片段。。
其中保护碱基，我一般设计1-3个碱基，序列具有随意性，只需要不要增加错配率就可以了。并且我一般用它来调节GC含量以及引物长度差异。所以网上流传的最好的保护碱基，大家看看笑笑就可以了，不需要在意。保护碱基的另外一个作用是提高同源性，大家可以在这个区域设计长一点的保护碱基，让这些保护碱基序列和你需要PCR的模板前面的序列匹配，当然啦，这个不是必须的，只是当你需要设计很长的保护碱基的时候，顺便可以优化自己引物的小窍门。
接着是酶切位点，序列是固定的，但是记得选择酶切位点的时候，需要确保你的基因以及载体上除了MCS的部分没有相应的酶切位点。
最后是同源片段。建议大家使用25-35bp，保证足够同源片段粘附在模板上进行PCR。整体引物GC含量在35-65%，最后一个碱基最好不要是A，也不要是重复的序列，如AAA TTT CCC GGG。引物发生的什么颈环结构啊，引物之间的错配啊，不要紧，最重要的参数是引物在你的模板上是否存在错配，只要确保最后一个碱基和模板不存在错配，问题就不大。
另外，我们还需要调整上下游引物的长度差异，一般来说，3bp之内。还有就是温度差异控制在2度为宜，这个可以通过保护碱基的长度以及同源片段的长度增删来实现。
结合以上所说的，你最后设计的引物就是大约30-45bp，非常好用，并且可以通过梯度PCR来摸索最佳的使用温度。Tm值是理论值，实际上什么温度最合适，还是要看实验结果为准，不要纠结。
3 PCR基因，关键是选择好酶，这一部分非常简单，就是用takara公司的primer starmax或者NEB 公司的phusion即可。剩下的注意事项，这两个试剂盒里面都说的非常好。
再补充一点，对于primerstar max来说，遇到过长的片段，我建议是5k就要开始使用30s/k了。而对于phusion对于难P的片段增加酶的用量（最多为建议使用量4倍），能够提高PCR的成功效率。
接着是PCR程序的设定，98度变性10-60s都可以。没有影响。
退火温度一般设置50-60度都可以。想摸索最佳温度使用梯度PCR。
延伸时间如上所言，而设置的整个cycle可以根据自己的原始模板量以及好不好P来决定，cycle在26-34之间摆动都可以，建议用30cycles。
最后72度再延伸3min，4度1min即可。由于primerstar max可以达到5s/k，价格也不贵，因而大家PCR将节省大量时间。
最后是PCR片段的回收，假如引物二聚体不严重，直接进行硅胶柱回收，否则用胶回收。其中胶回收回收率不高，大约50%，添加10%的异丙醇于65度处理的样品中，能够提高回收效率。
4双酶切，通常克隆转化失败就是酶切不成功。
酶切的关键也是使用好酶，建议用thermo的快酶节省时间，一般来讲质粒切10min，PCR片段纯化之后，只能够使用质粒最大处理量的一半，切30min，而如果没有经过纯化，只能够使用四分之一的处理量。其他没有需要注意的，酶切之后进行硅胶柱回收即可。
但是如果希望知道酶切的效果，建议使用自连接。即构建10ul的转化体系。其中加入8.5ul的PCR酶切片段，1ul的10x T4连接酶buffer 0.5ul的T4连接酶，于20度放置40min即可跑胶，如果发现呈现ladder条带，即可认为酶切成功，很多时候会出现一片模糊，这也是成功的，只是PCR酶切的总量太少所导致的。假如你发现只是出现两倍分子量的条带，说明你只有一个酶切成功了，假如只是出现分子量和原来一样的条带，要么你的T4连接酶失效了，要么就是你的两个酶酶切都不成功，后面两种情况都要重做。
最后再多加一个小窍门，对于没有合适酶切位点的，可以把整个质粒P下来，是的，你没有听错，是整个质粒P下来，然后两端你喜欢用什么位点就是什么位点，简单粗暴，亲测有效，不要担心什么突变率这类的问题，只要保真性好，试过9K多都妥妥的。
5连接建议还是使用thermo的快酶T4连接酶，20度30min-1h即可。此外建议PCR酶切片段：载体比例为3或者6。验证连接是否成功，可以通过通用引物或者自己在载体插入模板的上下游设计一对引物对连接产物进行PCR。若出现模板分子量的条带即可认为成功，反之只是出现引物二聚体则失败。记得不能够用模板本身的引物，因为连接并不是100%成功的，还有很多剩余的未连接成功的片段。
6转化转化关键在于感受态的制备。但是现在有很多公司都提供感受态的制备，效果也蛮好的，所以也不需要太关注这一方面的问题，关键是不能够污染以及合适的OD。
而转化需要注意的事项是，冰浴20min即可，接着42度热激，再次冰浴3min即可。37度220rpm复苏20min，甚至不复苏都能够取得很好的结果。
而对于涂布棒，建议大家先用报纸包住去灭菌，然后涂板的时候就直接拆开涂布就可以了。不需要在火上烧，然后晾干，节省时间以及减少因为涂布棒过烫热死细菌。
此外，通过事先制备的平板放置在37度培养箱一夜，就能够减少表面的水分，使得涂布变得非常的快。而假如需要涂布的总体积过大，比如500ul，可以通过离心去除上面的buffer，留下合适的体积进行后续的操作。此举也能够减少后续菌落PCR可能出现的假阳性。
7菌落PCR。菌落PCR每一管只需要10ul，建议使用快酶primer star Max。主意不要挑取过多的菌落，粘一下菌落即可，我试过最小的细胞量，其实一个细胞到10的6次方个细胞都可以实现PCR。而过多的菌落则会因为杂质太多以及原始模板量过大，导致PCR失败。
8最后是对菌落PCR成功的菌株进行质粒酶切验证。因为菌落PCR会出现一定的假阳性，建议大家是挑取2个菌落PCR的菌株进行后续实验。通过培养这两个菌落的细菌，接着进行提取质粒酶切验证。具体的操作如之前所说的一样，最后大家就成功的结束了。
经过这些小步骤的优化，基本上能够在7h之内完成菌落PCR之前的所有步骤。简单方便。
一般来说，克隆转化从开始到结束分为获取基因，设计引物，PCR基因，酶切，连接，转化，菌落PCR以及挑取克隆酶切验证几个步骤。下面我将根据时间顺序，对每一个部分进行说明以及优化。
1获取基因，获取基因的方式有以下几种：提取质粒，提取基因组，mRNA逆转录。
我在研究生阶段只是涉及了前面两种比较常用的方式。其中，提取质粒建议使用omega或者maxgen这两种试剂盒进行提取。操作步骤按照说明书即可。
其中质粒提取，需要注意的点为
1 不宜加入过多的菌体，平均一个EP管最多加入2ml OD=3的离心菌体。最好是加入OD=2就可以了。OD不需要事先去测量，大致上通过肉眼估计一下即可。一般来讲2-4mlOD=2的菌体就足够你获得很浓的质粒了（假如是PET28a这种就需要多加一点，一般使用20ml。因为一个细胞内只有10多个质粒，不像克隆载体有500个左右）
2加入溶液I之后要混匀，不要有残留的菌体粘在壁上。可以通过吹打，或者通过震荡的方式来实现混匀（大量处理组的时候）
3 加入溶液II之后混匀，上下颠倒10次即可。通过两个96孔放置EP管的板子夹住中间EP管便可方便操作完成此步骤。假如操作结束后，发现溶液变得很清亮，表示你的裂解效果很好，假如仍然浑浊，不建议继续操作，应该查看是否为杂菌以及是否需要添加溶菌酶等手段对细菌进行处理。
4 加入溶液III之后一定要混匀，随意混就可以了，上下颠倒5次。
5 之后的10min离心最烦恼的。现在maxgen试剂盒开发的质粒提取试剂盒只需要离心1min，能够节省这一部分的时间。
6 之后的上样于硅胶柱的时候，直接打开EP管，将上清倒入硅胶柱即可，节省枪头以及时间。调整转速为10000转1min即可，最后一次洗脱乙醇的时候14000rpm 3min即可，不需要之后对硅胶柱进行烘干或者用风筒吹，效果一样非常棒。
7 若想提高质粒的溶解效果，可以使用65度的dd水来溶解，建议都用水，不要用它给的solution来溶解，因为其中有盐，有的时候会对下游实验造成一定的干扰，比如说，你要进行电转什么的，其实两种buffer取得的结果都是不错的。
8最后在回收的质粒EP管上写上质粒的名称，日期以及操作人，养成良好习惯。因为我们的记忆实在不敢恭维，一定会忘记的。
而对于提取基因组来说，建议使用omega公司的bacteriaDNA kit效果蛮不错的，对于提革兰氏阳性细菌如枯草芽孢杆菌来说，只需要添加溶菌酶（加入2mg/ml效果最好，过多了会形成粉笔灰状的沉淀）以及蛋白酶K即可，非常方便，其他的无什么需要注意的地方，结合以上质粒提取的注意事项便能够获得良好的提取效果。
在提取DNA之后，一般需要进行跑胶鉴定，其中胶孔上面如果出现很亮的部分，是样品中残余的蛋白，而加入在低分子量区域有很亮的部分，是没有去除的RNA部分，可以根据自己的问题进行后续处理，比如加一下RNA酶这类的。
另外，提取出来的质粒一般具有2-3条带，原因是因为质粒分子构型不同以及质粒自身进行寡聚所致，因而对于质粒的分子量大小，不能以跑质粒的大小来鉴定，需要酶切鉴定。
2 设计引物
设计引物是困扰了很多初学者的难题，经常会有人相信公司设计的引物，而怀疑自己的能力，其实引物设计是一个必须要掌握的技能，也是很好掌握的技能。
在开头，必须强调一个原则，引物设计只有挑选最好的，而没有满分的选项，不要求全责备。不要经常去抱怨或者担心，会不会P不出来啊，这种问题，实践出真知。
首先我们说说引物序列的构成，从5-3端，分别是保护碱基 酶切位点 以及同源片段。。
其中保护碱基，我一般设计1-3个碱基，序列具有随意性，只需要不要增加错配率就可以了。并且我一般用它来调节GC含量以及引物长度差异。所以网上流传的最好的保护碱基，大家看看笑笑就可以了，不需要在意。保护碱基的另外一个作用是提高同源性，大家可以在这个区域设计长一点的保护碱基，让这些保护碱基序列和你需要PCR的模板前面的序列匹配，当然啦，这个不是必须的，只是当你需要设计很长的保护碱基的时候，顺便可以优化自己引物的小窍门。
接着是酶切位点，序列是固定的，但是记得选择酶切位点的时候，需要确保你的基因以及载体上除了MCS的部分没有相应的酶切位点。
最后是同源片段。建议大家使用25-35bp，保证足够同源片段粘附在模板上进行PCR。整体引物GC含量在35-65%，最后一个碱基最好不要是A，也不要是重复的序列，如AAA TTT CCC GGG。引物发生的什么颈环结构啊，引物之间的错配啊，不要紧，最重要的参数是引物在你的模板上是否存在错配，只要确保最后一个碱基和模板不存在错配，问题就不大。
另外，我们还需要调整上下游引物的长度差异，一般来说，3bp之内。还有就是温度差异控制在2度为宜，这个可以通过保护碱基的长度以及同源片段的长度增删来实现。
结合以上所说的，你最后设计的引物就是大约30-45bp，非常好用，并且可以通过梯度PCR来摸索最佳的使用温度。Tm值是理论值，实际上什么温度最合适，还是要看实验结果为准，不要纠结。
3 PCR基因，关键是选择好酶，这一部分非常简单，就是用takara公司的primer starmax或者NEB 公司的phusion即可。剩下的注意事项，这两个试剂盒里面都说的非常好。
再补充一点，对于primerstar max来说，遇到过长的片段，我建议是5k就要开始使用30s/k了。而对于phusion对于难P的片段增加酶的用量（最多为建议使用量4倍），能够提高PCR的成功效率。
接着是PCR程序的设定，98度变性10-60s都可以。没有影响。
退火温度一般设置50-60度都可以。想摸索最佳温度使用梯度PCR。
延伸时间如上所言，而设置的整个cycle可以根据自己的原始模板量以及好不好P来决定，cycle在26-34之间摆动都可以，建议用30cycles。
最后72度再延伸3min，4度1min即可。由于primerstar max可以达到5s/k，价格也不贵，因而大家PCR将节省大量时间。
最后是PCR片段的回收，假如引物二聚体不严重，直接进行硅胶柱回收，否则用胶回收。其中胶回收回收率不高，大约50%，添加10%的异丙醇于65度处理的样品中，能够提高回收效率。
4双酶切，通常克隆转化失败就是酶切不成功。
酶切的关键也是使用好酶，建议用thermo的快酶节省时间，一般来讲质粒切10min，PCR片段纯化之后，只能够使用质粒最大处理量的一半，切30min，而如果没有经过纯化，只能够使用四分之一的处理量。其他没有需要注意的，酶切之后进行硅胶柱回收即可。
但是如果希望知道酶切的效果，建议使用自连接。即构建10ul的转化体系。其中加入8.5ul的PCR酶切片段，1ul的10x T4连接酶buffer 0.5ul的T4连接酶，于20度放置40min即可跑胶，如果发现呈现ladder条带，即可认为酶切成功，很多时候会出现一片模糊，这也是成功的，只是PCR酶切的总量太少所导致的。假如你发现只是出现两倍分子量的条带，说明你只有一个酶切成功了，假如只是出现分子量和原来一样的条带，要么你的T4连接酶失效了，要么就是你的两个酶酶切都不成功，后面两种情况都要重做。
最后再多加一个小窍门，对于没有合适酶切位点的，可以把整个质粒P下来，是的，你没有听错，是整个质粒P下来，然后两端你喜欢用什么位点就是什么位点，简单粗暴，亲测有效，不要担心什么突变率这类的问题，只要保真性好，试过9K多都妥妥的。
5连接建议还是使用thermo的快酶T4连接酶，20度30min-1h即可。此外建议PCR酶切片段：载体比例为3或者6。验证连接是否成功，可以通过通用引物或者自己在载体插入模板的上下游设计一对引物对连接产物进行PCR。若出现模板分子量的条带即可认为成功，反之只是出现引物二聚体则失败。记得不能够用模板本身的引物，因为连接并不是100%成功的，还有很多剩余的未连接成功的片段。
6转化转化关键在于感受态的制备。但是现在有很多公司都提供感受态的制备，效果也蛮好的，所以也不需要太关注这一方面的问题，关键是不能够污染以及合适的OD。
而转化需要注意的事项是，冰浴20min即可，接着42度热激，再次冰浴3min即可。37度220rpm复苏20min，甚至不复苏都能够取得很好的结果。
而对于涂布棒，建议大家先用报纸包住去灭菌，然后涂板的时候就直接拆开涂布就可以了。不需要在火上烧，然后晾干，节省时间以及减少因为涂布棒过烫热死细菌。
此外，通过事先制备的平板放置在37度培养箱一夜，就能够减少表面的水分，使得涂布变得非常的快。而假如需要涂布的总体积过大，比如500ul，可以通过离心去除上面的buffer，留下合适的体积进行后续的操作。此举也能够减少后续菌落PCR可能出现的假阳性。
7菌落PCR。菌落PCR每一管只需要10ul，建议使用快酶primer star Max。主意不要挑取过多的菌落，粘一下菌落即可，我试过最小的细胞量，其实一个细胞到10的6次方个细胞都可以实现PCR。而过多的菌落则会因为杂质太多以及原始模板量过大，导致PCR失败。
8最后是对菌落PCR成功的菌株进行质粒酶切验证。因为菌落PCR会出现一定的假阳性，建议大家是挑取2个菌落PCR的菌株进行后续实验。通过培养这两个菌落的细菌，接着进行提取质粒酶切验证。具体的操作如之前所说的一样，最后大家就成功的结束了。
经过这些小步骤的优化，基本上能够在7h之内完成菌落PCR之前的所有步骤。简单方便。
