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        组织中 RNA 提取与检测

        相关实验:总 RNA 提取实验

        别名:组织总 RNA 提取,组织 RNA 抽提

        最新修订时间:

        简介

        组织中 RNA 提取与检测

        原理

        与从细胞中提取 RNA 的原理类似,在组织块中也是通过 Trizol 来提取 RNA的。通常组织块较大、较紧密,Trizol 难以快速的破坏组织块,所以需要先将组织块研磨。再加入 Trizol,能破坏细胞和溶解细胞成分,利用氯仿的萃取得到上层水相(含 RNA)、界面层和下层的红色有机相(含 DNA 和蛋白)。得到的水层用异丙醇沉淀并经过酒精的洗涤去除杂质,能分离大小不一的各种RNA。

        用途

        通过 RT-PCR 检测某组织中基因的表达情况。

        材料与仪器

        材料:组织块;Trizol 试剂;氯仿;异丙醇;75% 乙醇(使用 RNase-Free 水配制);RNase-Free 水;液氮。

        物品及仪器:1.5 ml EP 管(RNA-free);大、中、小号枪头(RNA-free);移液器;涡旋振荡器;高速冷冻离心机;超净工作台;匀浆机或研磨棒。

        步骤

        1.用组织剪将组织切成 1-3mm 的小块,放入 1.5mL ep 管中,加入 0.5-1 mL Trizol 裂解液(对于一些较硬的组织建议用液氮磨碎),用研磨棒将组织杵碎至看不见组织块(也可以用匀浆机,但是要注意清洗探头)。


        2.往上述 ep 管中加入 1/5 Trizol 体积的氯仿,剧烈震荡充分混合后,室温静置 10 分钟,使核酸蛋白复合物完全解离。


        3.在 4℃ 下 12000g 离心 15 分钟。


        5.离心后,将上层水相(约 1/2 Trizol 体积)小心转移到一个新的 EP 管,加入等体积异丙醇,震荡后室温静置 5-10 分钟,然后 12000g 4℃ 离心 15 分钟,弃上清保留沉淀。


        6.加入 1mL75% 乙醇清洗并沉淀 RNA,12000g 离心 10 分钟。


        7.弃上清,并重复上述操作一次,


        8.弃上清,在超净工作台中打开 ep 管盖,风干 5-10 分钟,不需完全干燥。


        9.视沉淀的量,加入 10-30 µL RNase-Free 的 DEPC 双蒸水中。


        10.待沉淀溶解后,用 nanodrop 测定其浓度和纯度并作标记,进行下游实验,多余的 RNA 保存于 -80℃ 冰箱。

        注意事项

        1.为避免研磨棒带来的 RNA 酶污染,应将研磨棒用 DEPC 水清洗并高压处理。

        2.过程中需佩戴口罩和新手套,对台面以及周围环境进行灭酶处理,尽量在超净台中进行操作。


        3.使用无 Rnase 的塑料制品和枪头,避免交叉污染。


        4.溶液配制应使用无 Rnase 的水,(将水加入到干净的玻璃瓶中,加入 DEPC 至终浓度为 0.1%(V/V),放置过夜,高压灭菌。注:DEPC 有致癌之嫌,须小心操作)。


        5.Trizol 裂解液非常危险,因小心避免溅到身上,台面上的 Trizol 要及时清理干净。

        常见问题

        一、RNA 质量不高
        1.取上层水相时求多,吸到了下层有机相;
        2.清洗不干净。

        二、RNA 样品中 DNA 污染
        1.现在很多商品化的反转录试剂中都有 DNA 酶,能有效的去除基因组 DNA;
        2.取样时吸到有机相。

        三、RNA 发生降解
        1.耗材的污染,换用新的耗材;
        2.环境污染,现在市面上有 RNA 酶清洗剂的出售;
        3.裂解液不足。

        来源:丁香实验

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