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        用普通的提取法从组织中提取RNA

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        1.1 匀浆
        1) 每个无菌的2 ml圆底离心管中加入1ml TRIZOL试剂,每个大鼠的腺垂体从-80°C取出后立即于预冷的TRIZOL试剂里用POLYTRON组织匀浆器(瑞士)进行匀浆。
        【注:1. 匀浆液的量按每50-100 mg组织加1 ml TRIZOL,样品的体积不能超过匀浆液体积的10%。 2. TRIZOL试剂用前应于4°C保存,操作时应带手套和口罩。3. 匀浆器头用前需在3% H2O2(DEPCC水配)里浸泡,然后于0.1% DEPC水中空转2次,最后于TRIZOL试剂中空转2次,方可用于匀浆。4. 匀浆时间不宜太长,转速不宜过大,刚开始时由慢到快至中档处,然后减速,重复1-2次,未见有组织碎块即可.5.假如样品数多的话,可先将TRIZOL试剂一并加好,然后逐一加入样品匀浆。6. 特注:每加完一种试剂,都应及时盖上管盖,夹取管子或者打开管子时,尽可能不要碰到管的内缘。】。
        2) 将匀浆样品置于15-30°C下静置5分钟,以使核酸蛋白复合物完全分离。假如所提取的组织中含有较多的蛋白、脂肪等,则应在匀浆结束后将匀浆液于4°C,12000 g,离心10分钟,取上清用于以下操作。
        【注:假如此匀浆液暂时不用于实验,可于-80°C下保存至少1个月。】

        1.2 RNA 提取
        1) 加0.15 ml氯仿(每1 ml匀浆液加0.2 ml氯仿),盖好管盖,用手剧烈振荡15秒,于15-30°C下静置3分钟。
        【注:假如样品数多的话,可先于一个无菌的离心管中倒入适量的氯仿,而勿需每次从大瓶子里吸取,这样可以减少污染,亦可加快速度】
        2) 4°C,12000 g,离心10分钟。
        3) 小心吸出上层无色溶液(约为匀浆液体积的60%)于另一个1.5 ml无RNAase的离心管中。
        【注:此步非常需要注重的是,在吸取上清时,切勿切勿将中间和底层的有机相吸出,宁愿少吸一点上清。同时,最好是用小枪头吸,这样就可以保证不吸到中间相】
        4) 加无RNAase的糖原10 μg(终浓度约为250 μg/ml,最多不能大于4 mg/ml),盖好管盖,充分振荡后,加入等体积的异丙醇(约400 μl),室温静置10分钟。
        【注:1. 糖原应不含RNAase,其作用是能够携带液相RNA溶液,有助于其沉淀。2. 在4°C下静置轻易使其它不重要的物质沉淀下来,所以最好在室温下静置。3. 假如样品数多的话,可先于一个无菌的离心管中倒入适量的异丙醇,而勿需每次从大瓶子里吸取,这样可以减少污染,亦可加快速度。】
        4) 4°C,12000 g,离心10分钟。
        5) 小心倒去上清。加0.75 ml 75%乙醇清洗沉淀(0.1%DEPC水配制。缓慢用枪头打起沉淀,均匀吹打几次。每1 ml匀浆液加1 ml 75%乙醇),涡旋振荡,混匀。
        【注:假如沉淀暂时不用于实验,可在加入0.75 ml 75%乙醇后,于4°C下至少可以保存1周,或于-20°C下至少可以保存1年。】
        6) 4°C,7500 g,离心5分钟。
        7) 重复步骤5)-6)。
        8) 小心倒去上清,轻甩2下后,用移液器小心将离心管内残余的液体吸出,打开管盖,将沉淀于操净台上晾干(5分钟即可,完全晾干后反而会降低沉淀的溶解另外,亦可将装有沉淀的管子盖紧盖子后,放进一次性手套中,然后打开管盖,稍微包扎手套后,于50°C烘箱中放置3分钟即可)。
        【注:假如来不急做完下面的工作,可将步骤8)所得到的沉淀于-80 °C保存。第二天直接从步骤 9)开始做,这样就可以增加RNA的保存,防止降解。

        (责任编辑:大汉昆仑王)
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