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        RNA提取

        相关实验:RNA提取及检测

        别名:抽提RNA,Trizol法提取rna,提 RNA

        最新修订时间:

        简介

         

        RNA提取

        获得高质量和完整的 RNA 是很多分子生物学实验中最重要的一步,当前应用最多的是 Trizol/氯仿萃取的方法。

        原理

        Trizol 是一种单相溶液,由苯酚和异硫氰酸胍等组成。通过加入Trizol,能破坏细胞和溶解细胞成分,利用氯仿的萃取得到上层水相(含 RNA)、界面层和下层的红色有机相(含 DNA 和蛋白)。得到的水层用异丙醇沉淀并经过酒精的洗涤去除杂质,能分离大小不一的各种 RNA。

        用途

        RT-PCR、分子克隆、Northern-Blot、RNA 体外转录与翻译等。

        材料与仪器

        【材料】细胞、Trizol 试剂、氯仿、异丙醇、75% 乙醇(使用 RNase-Free 水配制)、RNase-Free 水

        【物品及仪器】1.5 ml EP管(RNA-free)、大中小号枪头(RNA-free)、移液器、涡旋振荡器、高速冷冻离心机、超净工作台。

        步骤

        1、4℃ 预冷离心机;

        2、取出培养皿,在超净台中去除培养基,按照每 1x107 细胞加入 1 ml Trizol 试剂,用枪头吹打充分裂解细胞;

        3、将细胞裂解液转移到 1.5 ml 无 RNA 酶的 EP 管中,向每个 EP 管中加入(1/5 Trizol 体积的)200 μl 氯仿,上下翻转充分混合后,室温静置 10 分钟,使核酸蛋白复合物完全解离;

        4、在 4℃ 下 12000 g 离心 15 分钟;

        5、离心后,将上层水相(约 1/2 Trizol 体积)小心转移到一个新的 EP 管,加入等体积异丙醇,震荡后室温静置 5-10 分钟,然后 12000 g 4℃ 离心 15 分钟,弃上清保留沉淀;

        6、加入 1 ml 75% 乙醇清洗并沉淀 RNA,12000 g 离心 10 分钟;

        7、弃上清,并重复上述操作一次;

        8、弃上清,在超净工作台中打开 ep 管盖,风干 5-10 分钟,不需完全干燥;

        9、视沉淀的量,加入 10-30 μl RNase-Free 的 DEPC 双蒸水中;

        10、待沉淀溶解后,用 nanodrop 测定其浓度和纯度并作标记,进行下游实验,多余的 RNA 保存于 -80 ℃ 冰箱。

        注意事项

        1、过程中需佩戴口罩和新手套,对台面以及周围环境进行灭酶处理,尽量在超净台中进行操作;

        2、使用无 Rnase 的塑料制品和枪头,避免交叉污染。

        3、溶液配制应使用无 Rnase 的水,(将水加入到干净的玻璃瓶中,加入 DEPC 至终浓度为 0.1%(V/V),放置过夜,高压灭菌。注:DEPC 有致癌之嫌,须小心操作)。

        4、Trizol 裂解液非常危险,因小心避免溅到身上,台面上的 Trizol 要及时清理干净。

        常见问题

        RNA 得率过低:
        1、使用更有效的破碎/匀浆方法。如液氮捣碎、酶消化破壁、电动匀浆器匀浆;

        2、更换抽提试剂;

        3、核酸浓度低时,采用低温沉淀,并延长沉淀时间;

        4、增加细胞。

        RNA质量不高:
        1、取上层水相时求多,吸到了下层有机相;

        2、清洗不干净。

        来源:丁香实验

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