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        RNA提取流程

        互联网

        3189
        总RNA(total RNA)和信使RNA(mRNA)的抽提(自己的总结)

        1、实验目的
        提取人体细胞的总RNA和mRNA。

        2、本实验所需试剂
        1)、CNE-2细胞及培养细胞的一系列条件,
        2)、PBS缓冲液, TRIZOL试剂,
        3)、DEPC处理过的水、大、中、小Tip及1.5 ml EP管,
        4)、新的氯仿、异丙醇和乙醇,
        5)、mRNA分离试剂盒:Oligotex mRNA Mini Kit,Cat.no.:70022, QIAGEN。
        6)、新配的电泳缓冲液,专跑RNA的琼脂糖(Agarose)。

        3、实验流程(掌握内容)
        3.1 细胞总RNA的提取
        1)、6孔板细胞(CNE-2)汇合度为90-100%时,取出无菌室,去其上清,用PBS洗两次后,每孔加TRIZOL试剂(Gibco公司) 1 ml,摇匀,无菌罩内消化3-5分钟(观察:液体变粘稠,细胞脱壁)。
        2)、将各孔内消化好的细胞裂解液吸到一DEPC处理过的1.5 ml EP管中,加新开的氯仿0.2 ml,轻摇15秒。
        3)、室温静置2-3分钟后,12000 rpm,15 min,4℃,离心。然后取上清无色水相(约0.6 ml)到 EP管(DEPC处理过),加0.5 ml新开的异丙醇,室温下静置10分钟。
        4)、12000 rpm,10分钟,4℃,离心。观察总RNA在管底的白色沉淀,弃去上清(小心别丢了沉淀),75%乙醇1.0 ml洗涤(用DEPC水新配制)后,7500 rpm,5 min,4℃离心。
        5)、去上清,点离,用小Tip吸干液体。气干沉淀5-10分钟, DEPC处理水20-30 ul加入,中枪打匀,55-60℃水浴10分钟溶解总RNA,测OD值。
        6)、电泳。

        3.2 从总RNA中分离mRNA(Oligotex mRNA Mini Kit,Cat.no.:70022, QIAGEN)
        1)、取上述提取的总RNA若干(少于0.25 mg)到一个新的无RNase 的EP管中,用无RNase的水定容到250 ul。
        2)、加入Buffer OBB 250 ul, Oligotex Suspension 15 ul。用Tip打匀或用手弹匀。
        3)、70℃水浴,3分钟(裂解RNA的二级结构)。
        4)、20-30℃条件下,静置10分钟(让Oligotex与mRNA结合)。
        5)、高速离心2分钟,小心吸走上清(该上清要保留),留下约50 ul的上清在原管里。
        6)、用Buffer OW2 400 ul重悬含Oligotex/mRNA复合物的沉淀,然后将这些加到套有1.5 ml EP管的SPIN柱子上,高速离心1分钟。
        7)、将SPIN柱子移到一个新的EP管上,加Buffer OW2 400 ul到柱子,高速离心1分钟,丢掉滤过液。
        8)、将SPIN柱子移到一个新的EP管上,加20-100 ul热的(70℃)Buffer OEB到柱子上,用Tip来回吸打3-4次,高速离心1分钟。
        9)、为保证最大的 mRNA产量,可再次重复第8步。
        10)、电泳。

        4、mRNA的应用(了解内容):
        RT-PCR, Northern杂交,cDNA文库构建, mRNA末端快速扩增(RACE),差异表达(DDRT-PCR),引物延伸反应(Primer Extension),体外转录(In Vitro RNA Transcription), RNA标记(RNA labeling),RNA酶保护试验(RNase and S1 Nuclease Protection Assay),RNA微注射(RNA Microinjection)

         

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