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        实时定量 PCR 实验

        相关实验:实时定量 PCR 实验

        最新修订时间:

        简介

        实时定量 PCR( qPCR ) 于 1996 年由美国 Applied Biosystems 公司首先推出。传统 PCR 方法可对特定 DNA 片段进行指数级的扩增,并可以通过凝胶电泳的方法对扩增产物进行定性分析,也可以通过放射性核素掺入标记后的光密度扫描来进行定量分析。无论定性还是定量分析,都属于对 PCR 反应终产物的检测。但很多情况下我们更需要确定的是未经 PCR 信号放大之前的起始模板量。由于该技术不仅实现了 PCR 从定性到定量的飞跃,而且与常规 PCR 相比,它具有特异性更强、结果准确可靠、自动化程度高等特点。

        方法原理


        实时定量 PCR 的基本原理是依靠荧光标记物和自动化仪器,每次循环都可读出荧光强度,实时监测了反应进程中的 PCR 产物,从而更精确地实现了对模板样品的定量及定性的分析。实时定量 PCR 的基础在于反应起始的模板 DNA 量与循环过程的指数期的扩增产物量之间存在着定量关系,利用荧光信号的实时监测和计算,可以反映出这种定量关系。在 PCR 反应早期,产生荧光的水平不能与背景明显地区别,而后荧光的产生进入指数期、线性期和最终的平台期,因此可以在 PCR 反应处于指数期的某一点上来检测 PCR 产物的量,并且由此来推断模板的初始含量。


        方法应用


        实时定量 PCR 技术主要运用在以下几个方面:


        1. 实时定量 PCR 技术应用在肿瘤诊断和研究方面

        2. 实时定量 PCR 技术应用在基因突变及其多态性方面

        3. 实时定量 PCR 技术应用在病原体检测方面

        材料与仪器

        试剂:
        引物、荧光探针/荧光染料

        仪器:
        实时定量 PCR 仪

        步骤

        实时定量 PCR 技术的基本过程可分为如下几步:


        (一) 引物和探针的设计

        检查比对序列,先选择好探针的位置,然后设计引物使其尽可能地靠近探针。
        探针的设计原则是:
        1. 尽可能短,不要超过 30bp;
        2.Tm 值应在 68 - 70℃ 之间;
        3. 避免 5'-端是鸟苷酸 ( G ) , 以免发生悴灭作用;
        4. 选择胞苷酸 (C) 多于鸟苷酸 (G) 的链作探针,G 的含量多于 C 会降低反应效率。


        (二) PCR 反应及数据记录

        提取细胞或组织中的总 RNA、反转录 PCR。PCR 反应需要在实时定量 PCR 仪专用反应板或管中进行,加入所有反应试剂后,将反应板置入仪器内,按照仪器操作说明完成反应和数据记录。


        (三) 数据分析

        一般而言,荧光扩增曲线可以分成 3 个阶段:荧光背景信号阶段、荧光信号指数扩增阶段和平台期,其形状是一条平滑的"S" 形曲线。


        1. 标准曲线法的绝对定量用一系列已知浓度的标准品制作标准曲线。标准品可以是纯化的质粒 DNA , 体外转录的 RNA, 或者是体外合成的单链 DNA。

        2. 标准曲线法的相对定量属于自身相对标准曲线。所用的标准品只要知道其相对稀释度即可。在整个实验中样品靶序列的量来自于自身标准曲线,最终必须除以参照物的量。

        3. Ct 比较法的相对定量 Ct 是热循环仪检测到达设定的阈值荧光信号时所经历的循环数。假设每个循环增加 1 倍的产物数量,在 PCR 反应的指数期得到的 Ct 值反映起始模板的量,一个循环的不同相当于起始模板数 2 倍的差异。该方法不必制作标准曲线,但前提是目的基因与内参基因要有类似的扩增效率。

        注意事项

        常见问题及解决方案


        实时定量 PCR 过程中的常见问题有:

        (一)影响特异性的因素

        1. 由于引物或探针降解、引物或探针设计不合理而造成的 Ct 值出现过晚或无 Ct 信号出现。优化方案是设计更好的引物或探针;优化引物浓度和退火温度。 避免引物或探针降解可在进行实时定量 PCR 实验前通过电泳检测其完整性。

        2. 模板有基因组的污染而出现非特异扩增。优化方案是在 RNA 提取过程中避免 DNA 的污染,或通过引物设计避免非特异扩增。


        (二)影响重复性的因素


        目的基因的初始拷贝数较低,造成结果的重复性较差。应使用初始浓度较高的样品或减少样品的稀释倍数。如果待测样品中目的基因的量处于反应体系的检出限附近,那么最好使用复孔以保证结果的可靠性。如果研究者是进行首次实验,那么应选择一系列稀释浓度的模板来进行实验,以选择出最为合适的模板浓度,一般而言,使 Ct 位于 15 - 30 个循环比较合适。


        (三)标准曲线的线性关系不佳

        原因可能是
        1.加样不准,使得标准品不呈梯度;

        2.标准品出现降解;

        3.模板浓度过高。理想的标准品应与样品具有高度同源性,虽然标准品和样品之间的差异始终存在,在制作标准曲线时,应至少选择 5 个稀释度的标准品,涵盖待测样品中目的基因量可能出现的全部浓度范围。


        (四)影响敏感度高低的因素

        实时定量 PCR 由于使用了荧光物质作为定量工具,敏感度通常能达到 100 拷贝/ml, 对数期分析线性范围很宽,为 0 - 1011 拷贝/ml。影响实时定量 PCR 敏感性的因素众多,除了对一般 PCR 反应均存在的影响因素如反应体系、Taq 酶的活性之外,还需注意如下因素:


        1. 特异性产物与引物二聚体竞争荧光染料 SYBR Green, 从而降低了实时 PCR 的敏感性。可用 TaqMan 探针代替 SYBR Green。

        2. 使用热启动方法加强特异性。在反应体系达到引物退火温度时才加入某一反应成分,因为引物二聚体是在各种试剂一经混合便开始形成的,所以用这种方法能有效地减少引物二聚体的形成。

        3. 要尽可能地优化引物设计。使两条引物的 GC 含量大致一致,使用纯化的引物进行实验等都有助于防止引物二聚体形成。

        4. Mg2 +的浓度。Mg2 +是影响 Taq 酶活性的关键因素。Mg2 +浓度过低无法使 Taq 酶发挥最佳活性,浓度过高又会增加引物二聚体形成。一般来说,对以 DNA 或 cDNA 为模板的 PCR 反应,应选择 2 - 5 mmol/L 浓度的 MgCl2; 对以 mRNA 为模板的 RT-PCR 而言,则应选择 4 - 8 mmol/L 浓度的 MgCl2

        来源:丁香实验

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