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        用光密度及数值分析法决定蛋白质结合的平衡常数

        相关实验:DNA 酶 I 足迹分析法实验

        最新修订时间:

        材料与仪器

        步骤

        1) 用胶片扫描装置构建一个该胶片的二维数字图像。


        2) 对每个结合位点的被保护DNA区带,在每条泳道 上(也就是各配体的每一浓度)的光密度进行积分。


        最好是将连续的条带群作为单独一组(即图中的方块)来分析。只要所有被包括在内的条带均匀地出现,这种简化是合适的。在所有的泳道上密度最大而且密度较相似的条带之间的最低密度处(也就是高度保护区)画出边界以选定各方块的两端。很关键的是,胶片的每泳道中各方块内都含有完全相同的条带。


        3) 为胶片局部背景光吸收而校正各泳道中的各方块的光密度积分值。可用图像分析软件进行如下计算:


        a. 在各方块所在位置上,选定各泳道之间空白处的中心,定义小长方形


        b. 计算各小长方形中的像素光密度值的直方图,将概率最高的像素光密度值定义为局部背景。


        c. 对于每方块和每泳道,分别算出泳道每侧的平均背景值。


        d. 将该平均值乘以方块中的像素数目。


        e. 从光密度积分值中减去所得值即得到该方块中的光密度积分校正值。


        4) 将各组结合位点的校正光密度积分值对该泳道中的总DNA值进行标准化。


        a. 选择1个或多个方块,除去滴定点及非常高敏感的区带,来代表泳道中的DNA总浓度。


        b. 按步骤2及步骤3测定这些标准块的光密度积分校正值。


        c. 计算每组结合位点的光密度比值(Dsite/Dstd)。如果选择不止一个标准组(方块),则将其和作为Dstd。


        选择两个大标准块较为实际,也足够了。其中一个靠近电泳起始处而远离结合位点, 另一个则在离起点更远处。仔细检查每个标准块内配体浓度依赖性的系统误差,这种误差可导致标准无效。


        5)将OD比值按以下公式换算成保护分数值(f):


        f= 1-( Dn, site/Dn,std)/ ( Dr, Site / Dr, std )


        式中,n为确定蛋向质配体浓度的任一电泳道;r为参考泳道(每个实验都必须设置), 其中在反应混合物中不加蛋白质配体。用各组结合位点的/值对蛋白质配体浓度制作结合曲线。


        如果按所述的方案做,而对照实验(Brenowitz et al.,1986a,b)显示DNA酶I的作用对蛋白质-DNA结合平衡常数无影响,f值就达到了饱和分数值(F)。能观测到的f值往往不能覆盖全程(0〜1)。其原因之一是无法在加DNA酶I之前计算DNA的切口 (也就是,即便在饱和配体浓度时,Dn,siK>0。因此,在分析数据时,最好将f值定义为与结合曲线成正比的转换曲线,将两条曲线的极限值U和f分别为上限值和下限值)作为可调节参数。


        对于单结合位点或相互之间无协同作用的多结合位点,其结合曲线为Langmuir等温线.

        注意事项


        来源:丁香实验

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