DNA酶I足迹分析法

1）用限制性内切核酸酶消化约5 pmol质粒，使得在距第1个蛋白质结合位点25〜100 bp处产生一个3'凹端

2) DNA用乙醇沉淀，用1 mL冰冷的70%的乙醇洗1次，在Speedvac真空旋转蒸发器中干燥。DNA沉淀重溶于5μL TE缓冲液中。

3) 加入适当的[α-³²P] dNTP水溶液，每种各50μCi，再加入5μL 10× Klenow酶缓冲液，加水至49μL；加1μL Klenow酶（5〜10 U），轻轻混合并离心，室温温育25 min。

4) 加2μL 5 mmol/L 4dNTP混合液，混匀，温育5 min。

5) 用离心过柱法除去未掺入的核苷酸。DNA如步骤2—样用乙醇沉淀。

6) 用第二种限制酶消化，产生仅在一条链及一个末端上标记的限制性片段，切点位于最远离标记末端的蛋白质结合位点>150 bp。

7) 用琼脂糖凝胶电泳，随后用电洗脱及反相层析法纯化含有结合位点的标记DNA。

8) 如步骤2—样用乙醇沉淀DNA。将DNA溶解于100μL，pH 8.0的TE缓冲液中。在 4℃保存，不要冻结。

9) 取0.5μL DNA溶液放入水性闪烁液中计数，以测定DNA的放射性。

10) 在10 mL—次性塑料管中准备n+2 份180μL分析缓冲液，其中n为实验中结合反应的份数。计算达到10 000〜15 000 cpm/泳道的³²P标记的DNA的体积。加入³²P标记的DNA，轻轻在涡旋混合器上振荡混匀。

分析缓冲液的成分（如A或B)取决于蛋白质的性质、蛋白质-DNA系统以及所要解决的问题。DNA酶I的活性需要有微摩尔浓度的Mg²⁺和Ca²⁺存在。

11) 将含有32P标记的DNA的分析缓冲液按180μL /管分装入n+1个1.5 mL硅化的微量离心管中，多余的1个管作为不加DNA酶I的对照。

12) 对蛋白质进行系列稀释以覆盖所要分析的浓度范围。

结合蛋白的浓度范围应达到能覆盖所有蛋白质结合位点饱和度的0〜99%，并且应以等间隔浓度的对数值表示，至少要有几个点用来确定滴定曲线的渐近线

13)根据需要取2〜20μL稀释的蛋白质溶液加入各管中。加分析缓冲液（不含32P标记 的DNA)至终体积200μL /管。

14)轻轻混合，稍加离心，在所需温度的水浴中平衡30〜45 min。

15) 准备过量的DNA酶I终止液（700μL/管），置于干冰/乙醇浴中。

16) 准备>500μL用无BSA及小牛胸腺DNA的分析缓冲液稀释的DNA酶I溶液。将它同样品一起置于调节好水温的水浴中平衡。

17) 准确吸取5 稀释的DNA酶I加入第1管样品中，轻柔且迅速混合，马上放回水浴中。将定时钟设置为2 min。

18) 刚好2 min后，迅速加入700μLDNA酶I终止液。在涡旋混合器上剧烈振荡混匀，将管置于干冰/乙醇浴中。DNA酶I作用的时间和浓度可作改变（在各次实验之间，但不要在同一次实验之中），只要二者的产物（即产生的DNA切口的数量）保持恒定。作用总时间不成为问题。

19) 每管都重复步骤17和步骤18的过程。

20) 在步骤11准备的对照管（不含DNA酶I)中加终止液。

21) 在干冰/乙醇浴中沉淀DNA15 min以上。当最后一管放入之后开始计时。

22) 离心15 min,用移液管小心移去上清。加1 mL预冷的70%乙醇，离心5 min。用移液器小心吸掉上清，因为此时沉淀很松散地接触在管壁上。重复洗1次。在 Speedvac真空旋转蒸发器中干燥沉淀（10〜15 min)。

23) 将DNA重悬于5 μL甲酰胺加样缓冲液中：在试管的内表面上方滴出缓冲液，拍打试管使缓冲液沉下。涡旋混合器上剧烈振荡，离心几秒钟。重复两次。

24) 如果不马上进行电泳分析，可将样品保存在-70℃过夜。

25) 制备聚丙烯酰胺DNA测序胶并预电泳。

26) 在预电泳时，将样品置于干热式电加热块中90℃加热5〜10 min,立即浸入冰水中。当凝胶温度达到50〜55℃时，切断电源，小心加样，确定吸完所有管中的加样缓冲液。

27) 电泳至蛋白质结合位点移至胶的中部或略下。用标准方法固定（只对梯度胶）和干胶。

28) 凝胶用经预闪处理的Kodak ×-Omat AR胶片及单块钨酸钙增感屏在-70〜-85℃放射自显影。使胶片预闪处理过的面对着凝胶。每块凝胶做2〜3张自显影片（不同的曝光水平）以确保合适的曝光。

29) 在相同的条件下冲洗胶片。

30) 小心保存胶片，胶片之间插入纸片。划痕、指纹、污垢产生的光学信号很难与32P区分。用放射自显影图作定量分析。