基本方案1 用 DNA 印迹杂交检测克隆抗原受体基因重排

相关实验：分子生物学方法分析白血病和非霍奇金氏淋巴瘤的DNA重组实验

最新修订时间：2024-05-13

材料与仪器

实验材料	DNA 样品
试剂、试剂盒	适当的限制性内切核酸酶 6 X gel 加样缓冲液探针DNA 低盐洗液 3 X 和 2 X SSC 预杂交液杂交液高盐洗液正常和重排控制 DNA
仪器、耗材	跑胶缓冲液的循环泵培养器有合适的紧的带盖的塑胶盒离心导管平台摇床洁净的海绵 Whatman 3MM 过滤纸 G50葡聚糖凝胶柱水浴 UV 交联剂

步骤

25cm 0. 8 % (m/V ) 的琼脂糖胶，选用 I m m 厚的8 孔梳子。 3. 加入 8^1 6X 上样缓冲液（终浓度为i x )，点样。在一个孔中点上分子质量标记。用带有缓冲液循环泵的电泳仪40V 电泳 20〜24h ，至大分子质量D N A 迁移出孔超过 3cm。拍照，显示分子质量标记。将胶置于透射紫外灯上lm in 以切断〇1^八。切下左下角便于以后的分析。 4 . 将胶泡在 1.5m ol/LN aCl/0. 5m ol/L N aO H 溶液中 30min，间隔晃动。用水冲洗胶。将胶泡在〇.5111〇1/1^1>丨undefined〇1/3111〇1/1^他〇1溶液中3〇111丨]1，间隔晃动。用水冲洗胶。 Southern印记过夜将DNA转移到尼龙膜上（附录 3 G ) ，选用缓冲液浸湿过的干净的海绵半浸在缓冲液里，上面覆盖Whatman3M M 滤纸，而不用纱布条固定。 5. 拆开转膜装置。用铅笔在尼龙膜底部做标记。如果膜的不同部分需要与不同探针杂交，可以用单面的刀片按照胶孔的指示将膜切开。用 2X S S C 浸膜。用紫外线交联仪将 D N A 与尼龙膜交联。将膜夹在 Whatman 3M M 滤纸中，用保鲜膜包好，室温保存。 6. 用 3X S S C 将膜浸湿，把膜放人一个可以热封口的袋子里。将袋子的三边热封好，每边封两次。加入 IOml与杂交溶液。用塑料移液器头在袋口处来回搅动以排出气泡。封好第四边。将杂交带粘在平板摇床上放在温箱里。 42〜45°C 预杂交3〜24h 。 7. 用随机寡核苷酸引物标记试剂盒和50^0 [〇 r 32P] d C T P 将探针D N A 进行同位素标记，达到活性SXlOScpm/^g。采用色谱法用0 5 0 葡聚糖凝胶柱纯化探针，将其于未结合的核苷酸分离。将探针置于带有盖锁的试管中沸煮IOmin, 于冰上冷却，最高转速点离。 8. 剪开杂交带，去预杂交液。加人 IOml杂交液和沸煮过的探针，加入探针的量按每 IOOcm2 膜 IOXlO6〜40X106c p m 来计算。去气泡封好杂交带，将其贴在平板摇床上 42°C孵育过夜（不少于8h)。 9. 将膜从杂交袋中取出，放人干净的盖子可以扣紧的塑料盒里，加人 500ml高盐溶液。室温摇5min。将有放射性的杂交液和洗液妥善处理，再加入 500ml新的高盐溶液。室温摇5min。 10. 去净高盐溶液并取出膜。向盒中加入65°C 的低盐洗液再放人膜。注意不要将热的溶液直接倒在膜上。盖上盖子，在 65°C 水浴里静置20〜30min。如果做的是多张膜印记，则须在15min后改变膜的叠放次序。 11. 倒掉洗液，再重复洗膜，直到用Geiger测量仪检测到膜的放射性接近背景值。如果放射性自显影背景过高则在更高的温度下（66〜 68°C ) 用低盐洗液再次洗膜 30min。用 Geiger测量仪检测，必要时再重新洗膜。 12. 将印记好的膜在3 M M 滤纸上干燥后用保鲜膜包好放入有强化屏的可以扣紧的显影夹中紧靠着X 线。一70°C曝光3〜4d (对于背景较高的膜则曝光8〜12h; 对于肿瘤组织较少的可以延长曝光时间到7d)。洗片。如果在杂交过程中存在问题，请参考表 10. 3. 2。

1• 将 1〜2m l 骨髓或5m l 全血置于15m l 离心管中，加等体积的P B S , 混匀。小心地将聚蔗糖泛影钠溶液铺在样品/P B S 混合物（3m l 聚蔗糖泛影钠/6m i 混合物）或者是在聚蔗糖泛影钠顶部的层数样品混合物下。用离心机在室温下 400g 离心30〜40mino 2 . 去除上层的血浆和血小板，避免冲击单核细胞层。用一新移液管吸取并转移单核细胞层到15m l 的离心管中。用 P B S 洗两次。 3. 使用标准方法（附录3A ) 分离 g D N A 。用无菌水重悬D N A 至浓度为0.1卩 g/p l 。 4•按以下顺序配制主反应液（每反应39.754)。根据反应计划将体系加倍（包括正常、重组和无D N A 对照），考虑到加样误差还需在此基础上再增加一个体系。使用带筛

子的移液管以避免样品污染。 18.75jlJ 无菌水； 5“ 10X PCR扩增缓冲液（终浓度为I X ); 3jul 25mmol/L MgC^ (终浓度 I. 5mmol/L); 8；ul lOmmol/L 4dNTP 混合物（终浓度 I.6mmol/L); 2. 5“ lO^mol/L免疫球蛋白重链V h 外侧引物（终浓度0. 5^m〇 l/L); 2. 5j^l lOjumol/L免疫球蛋白重链Jh 外侧引物（终浓度〇 .5jumol/L); 将主反应液轻柔祸旋混匀并置于紫外线交联器照射l〇 min。 5•按照每个反应0 •254 5U/ 4 T叫 D N A 聚合酶的量将其加入到主反应液中。轻柔涡旋混匀后将主反应液分装到各个反应管中，每管 40W。向对照和样品反应管中加入用 IOju I 无菌水溶解的IiUg模板 DNA，向无 DN A对照反应管中加入1〇4无菌水。如有必要则在反应体系上覆盖矿物油。 6• 将反应管置于热循环仪中，运行以下扩增程序。初始步骤： 2min 95°C (变性) 29个循环： IOs 95°C (变性) 30s 40°C (退火) 30s 70。。（引伸） 1 个循环： IOs 95°C (变性) 30s 40°C (退火) 7min 75°C (延伸) 最后步骤：无穷 4°C (恒温）循环参数根据 Perkin-Elmer Cetus 9600热循环仪进行优化。 7. 取 5 H 1 P C R 产物用0. 5 X T B E 配制 2 % (质量体积比）琼脂糖胶进行水平电泳检测 (附录30)。用 0.5哗/1111溴化乙锭染胶，在紫外透摄灯下观察是否有10(^? ? 0 ^ 产物。 8. 按照第4 和第 5 步所述配制第二轮P C r 反应体系，将引物替换为V h 和 Jh 内侧引物。将 Ijul第一轮P C R 产物用9/^1无菌水稀释后加入到反应管中。如果第一轮反应用电泳检测到存在非特异性扩增或者有引物二聚体形成则需增加第一轮反应产物的用量。 9• 将反应管插入热循环仪中运行上述循环程序，将退火温度改为58°C，检测反应产物，如有产物扩出则进行第1〇步。 10• 将 V 反应产物和1^10.211/4 Klenow片段混合，于 37°C静置 lh，向反应体系中加入 IjlJ 6 X 上样缓冲液上样到12% (质量体积比）非变性聚丙烯酰胺凝胶（单元 7. 2 和 C P M B 单元 2. 7)， 2800VX h 电泳（如 200VX 14h)。备选方案2 P C R 和变性梯度凝胶电泳检测克隆T 细胞受体基因重组附加材料（基本方案1 ; 标V 的条目参见附录1) V I OX扩增缓冲液

$5 4 I O X P C R 扩增缓冲液（终浓度为I X ) ; 3|ul 25mmol/L MgCl2 (终浓度 I. 5mmol/L); 8jul 10mmol/L 4dNTP 混合物（终浓度 I. 6mmol/L); I. 25jul 10|um〇 l/LV7J h 侧引物（终浓度 0 •25jumol/L); I. 2^1 lOjumol/L 乃外侧引物（终浓度 0. 。将主反应液轻柔涡旋混匀并置于紫外线交联器照射l〇 m m 。 2.按照每个反应0. 25^1 5U/； xl Tag D N A 聚合酶的量将其加入到主反应液中。轻柔涡旋混匀后将主反应液分装到反应管中，每管 4〇 M 。向样品反应管和正常、重组对照中加入IOiLJ 0. lpg/jul的模板D N A ，向无D N A 对照反应管中加入IOjliI无菌水。如有必要则在反应体系上覆盖lOOpl矿物油。起始步骤： Imin 95°C (变性) 29个循环： 15s 95°C (变性) 30s 40°C (退火) 30s 70°C (延伸) 1 个循环： 7min 75°C (延伸) 最后步骤：无穷 4°C (恒温）循环参数根据 Perkin-Elmer Cetus 9600热循环仪进行优化。 3. 取 5julPCR产物，用 1.2% (m / \ 0 琼脂糖在0.5X T B E 缓冲液（附录 3G ) 中进行水平凝胶电泳。用〇.5jug/m l 溴化乙锭染色，在紫外线下成像，产物为500bp。 4 . 准备第二轮P C R ，按下述成分配制总反应液（每反应管9〇 4): 58. 5 4 灭菌水； 1〇 4 10X PCR扩增缓冲液（终浓度I X ) ; 16jul 10mmol/L 4dNTP 混合液（终浓度 I. 6mmol/L); 2. 5jul lOjumol/L inner V7i 引物（终浓度 0. 25jamol/L); 2. 5jutl 10/umol/L inner Jy 引物（终浓度 0. 25/xmol/L); 0. 5 4 5 U /4 T叫 DNA 聚合酶。轻柔涡旋振荡，每反应管中加入90W 总反应液。 5. 每反应管中加入第一轮 P C R 产物。把反应管放置在P C R 仪上，并按第3 步程序进行扩增，将循环数由2 5 减少到 15。用 I O j u l反应产物检测是否有500b p 扩增产物。 6. 把剩余的 90jul反应产物加入0. 5m l 离心管中，加入 IOlUl 3mol/L 乙酸钠和250/xl 1 0 0 % 乙醇。一 20°C 孵育 30min。 4°C ，最大转速离心30min。弃去乙醇，让 D N A 沉淀自然干燥，然后重悬于水中。 95°C 孵育 5min， 60°C 孵育 lh，以使 D N A 变性。 7. 制备浓度梯度为3 0 % 〜6 0 % 的尿素/甲酰胺变性液（ C P H G 单元 7. 5)。在样品中加入 5^1 60°C 预热的 D G G E 上样缓冲液，最高转速短暂离心，并立即上样至胶中。 60°C ， 150V电泳6h。如果此方法没有检测出D G G E ，用 V 引物重复整个过程再做一'次$

来源：丁香实验

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