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基本方案2 使用反转录 PCR 检测染色体易位

相关实验：分子生物学方法分析白血病和非霍奇金氏淋巴瘤的DNA重组实验

最新修订时间：2024-05-13

材料与仪器

实验材料	骨髓和血样中提取的 RNA 沉淀
试剂、试剂盒	第一轮 PCR 引物组 RNA 酶抑制剂 DEPC 水 10 X PCR 扩增缓冲液 MgCl2 第二轮 PCR 引物组 DTT 4dNTP 混合液 Taq DNA 聚合酶 5 X 反转录缓冲液反转录酶矿物油
仪器、耗材	热循环仪适用PCR管水浴器材

步骤

1. 在 P C R 管中装入Ijug由骨髓或血液提取的R N A ，再加入20W D E P C 水。 70°C 孵育 10min。冰上冷却，高速短暂离心。冰上保存。 2 . 按下列成分配制反转录总反应液（每管 38W): 8|ul5X 反转录缓冲液（终浓度I X ) ; 15"1DEPC 水； 8jul 2. 5mmol/L 4dNTP 混合液（终浓度 0• 5mmol/L); 4jul 0. lm ol/L DTT (终浓度 l 〇 m m ol/L); ljullOymol/L 引物 I (终浓度〇 . 25jumol/L); ljaWOOU/juJ反转录酶（终浓度5U/jul)。加入 2 4 1 ^ 八，混合。 37°(：孵育1}1， 95°(：加热5111丨11。室温短暂高速离心。冰上保存。 3. 要进行易位检测，需要制备两种总反应液（对照和融合测试；表 10. 3. 3)。同时制备无 R N A 对照以及对应阳性对照和阴性RN A 对照的总反应液。在每管总反应液中加人 1 8 4 反转录酶，如有需要，盖上约 IOOlUl矿物油，放人热循环仪中，进行以下反应：起始步骤： 4min 94〇C (变性）

基本方案2 使用反转录 PCR 检测染色体易位

4•将2^1反应产加入 198M 水中。祸旋混匀，短暂离心。准备两种总反应液（对照和融合测试；表 10. 3.4)。将 IOj^l稀释的第一轮P C R 反应产物加入到对应总反应液，按照第3 步反应条件进行热循环，仅将循环数由26 改为 30。 5.每个第2 轮 P C R 产物取15^1，在含 0.5^g / m l E B (附录3G ) 的 2.5 % (m /V ) 琼脂糖上电泳检测。大片段易位会产生305b p 和（或）230b p 的条带，小片段易位会产生 197b p 的条带。如果两者同时存在，大片段和小片段融合m R N A 可能产生262bp 的条带。对照组产生l〇6b p 的条带。

支持方案1 胍盐法快速抽提R N A 材料由 1〜2m l 骨髓或5m l 全血中分离的单核细胞（备选方案1，第 1 和 2 步） V 不含钙离子和镁离子的HBS S V R N A 分离溶液I 2mol/L 乙酸钠， pH4 V 平衡酚 24 : I (V /V ) 氯仿/异戊醇 1 00%和 7 0 % (V /V ) 乙醇 V R N A 分离溶液H V D EPC处理过的水 1. 用不含钙镁离子的H B S S 洗单核细胞沉淀一次。用 H B S S 重悬细胞并分到 3 个 1.5m l 离心管中。 I O O g 离心 2m i n。去上清。马上使用或保存在一70°C不超过 4 个月。一管用于抽提R N A ，其余两管用于重复分析。 2 . 向细胞沉淀加入〇.5ml R N A 分离溶液 I 。反复吸打使细胞破裂。加入 0.05ml 2mol/L 乙酸钠。涡旋，最大转速点离。加入 0.5m l 平衡酚。涡旋，离心。加人 0. Iml 24 : 1氯仿/异戊醇。涡旋， 4°C 最大转速离心15min。 3. 将 0.4m l 上层的水相转移到新的预先加人了 0.8m l l 0 0 % 乙醇的1.5m l 离心管中，小心在吸出水相时不要破坏分层界面。于一20°C 静置长于 lh。 4°C 最大转速离心 15min0 去上清。 4. 向沉淀加人300^1 R N A 分离溶液n ，涡旋使沉淀重悬。最大转速点离。加人 6004 1 0 0 % 乙醇，混勻。一20°C 静置长于 lh。 4°C 高速离心 15min。去上清。用〇.5ml 7 0 % 乙醇洗沉淀。去除乙醇。如果沉淀从管底飘起则先4°C 高速离心 5m i n 再去除乙醇。 5•用石蜡膜盖住开口的离心管，用针在上面戳几个孔。短暂真空干燥沉淀或令沉淀自然干燥。在一70°C 或更低的温度下保存干燥的R N A ，如果可以马上进行分析则将 R N A 溶于 2〇 4 DEPC处理过的水中。备选方案3 用 P C R 在 D N A 样品中检测染色体易位在 9〇%滤泡淋巴瘤和3〇%大细胞淋巴瘤中存在t (14; 18) (q32.3q21.3)易位，造成的位于18号染色体的基因上的断裂位点集中在一个或两个 D N A 区域（图 10. 3. 3)。附加材料（基本方案2) 〇 • V g /jul从骨髓或外周血中提取的样本D N A 或对照D N A (备选方案1，第 1〜3 步） lOymol/Lt (14; 18) (q32. 3q21. 3 ) 引物（图 10. 3. 3) 内部寡核苷酸探针序列（可选）

1 . 对于每一个标本，按照表10. 3. 3 配制对照和主要断裂点（ m b r ) 主反应混合液。向对应管中加人20jul 0. Iju g / 的样本与对照D N A 。如果有必要则在上面覆盖100/^1 石蜡油，放人热循环仪。运行以下程序起始步骤： 4min 94°C (变性) 30个循环： Imin 94°C (变性） Imin 55°C (退火） Imin 72°C (延伸） 1 个循环： 8min 72°C (延伸）最终步骤：无穷大 4°C (恒温）

循环参数根据Perkin-Elmer Cetus 480热循环仪进行优化。 2 . 向 198W 水中加入2^1上述反应体系。混匀，点离。按表 1〇.& 4 配制主反应体系。用第二轮槽式P C R 引物。加入 IOjlJ 稀释的第一轮反应产物，运行第一步扩增程序。 3 . 每个第二次反应产物取15/^1用含 0. 5p g /m 卜溴化乙锭的2. 5 % (m /V ) 琼脂糖胶进行电泳分析（附录 3 G )。主要易位断点将产生1〇〇〜3〇〇 bp 的片段。对照则产生 386b p 的片段。 4 . 如果上述方法没有检测出易位，重复第1〜3 步，采用特异性扩增微断裂点融合的主反应体系（表 10. 3 . 4 ) 和引物（图 10. 3. 3 ) ，将退火温度改为58°C 。不要重复对照 (考虑到D N A 的完整性）。主要易位断点将产生2〇〇〜i2〇〇 b p 的片段。 5 . 如果对于某条带是否代表易位有疑问，则可选择合适的内部寡核苷酸探针序列用 Southern印记杂交进行验证（附录 3G)

来源：丁香实验

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