β-半乳糖苷酶表达型扩增载体

β-半乳糖苷酶表达型扩增载体

材料

试剂

Dulbecco 基 本 培 养 基（D M E M ; G I B C O B R L ) , 无菌、高糖、含 L -谷氨酰胺、无硫 丙 酮 酸（ Invitrogene 或其他同类产品）

D u l b e c c o 磷酸盐缓冲液（ D P B S )，无菌、无钙离子/镁离子
乙 醇（7 0 % V /V )

胎 牛 血 清（F B S ; 无菌，支原体检查）

戊 二 醛（25%)

铁溶液：
165m g 氰化钾

211m g 亚铁氰化钾

20 mg 的 NP-40 (Tergitol)

I O m g 脱氧胆酸钠

19m g 氯化镁

加人 P B S 使总体积为 100 ml。用锡箔封住瓶口，储存在 4°C 中。

N I H -3T 3 细 胞（ A T C C : C R L -1658 )

TE ( 0. 25% 胰酶/0• 02% EDTA; Invitrogen)

水 ，去 离 子 d H 20 ) ，无菌

X -gal原 液（ 5-溴-4-氯-3-吲哚令-β-半乳糖苷； 20m g /m l 二甲基亚砜）

仪器

Bioguard 生物安全柜（ Baker Steriguard II 或同类产品）

细胞培养 M (24 孔 ； Corning 或同类产品）

细 胞 刮 刀（大号； N u n c 或同类产品）

离 心 管（锥形， 15m l 和 50m l , 无菌； C o m i n g 或同类产品）

C 0 2/H 20 套式培养箱 [ (37±1.0)°C ， 5 % C O 2; F o r m a 或同类产品]

培 养 瓶（T -150, 无菌； Corning 或同类产品）

冰箱：标 准（一 20°C ) 和 超 低 温（一 80°C )

血细胞计数板

倒置相差显微镜（Zeiss Telaval 31 或同类产品）

乳胶检查手套（无粉）

微量离心管（〇 • 5m l 和 I.7m l ，无菌； A x y g e n 或同类产品）

微型离心机 （National Labnet C -1200 或同类产品）

微型涡旋振荡器 （V W R 或同类产品）

电动移液器 （D r u m m o n d 或同类产品）

移液器和无菌吸头 （可调体积；Rainin P -20、 P -200 和 P -1000 或同类产品)

一次性移液管 （5m l 、 I O m l 和 25m l 容量，无菌）

水浴锅，（3 7 ± 1 )°C ( V W R 1235 或同类产品）

方法

1•为需要滴定的所有孔预热足够的 T E 和 含 5% 胎牛血清的 DMEM 培养液到 37°C

2 . 在生物安全柜操作，无菌移除细胞里的完全培养基。

3 . 小心用 5m l 无钙离子和镁离子的 D P B S 清洗细胞，去除液体。

4 . 用无钙离子和镁离子的 D P B S I : 1 稀 释 T E 。加 人 2m l 稀释的 T E 到每个 N I H -3T 3细胞瓶里。

5•在室温或 37°C 中孵育细胞直到细胞完全脱离瓶底。每 5m i n 观察一次，轻轻晃动，使细胞脱落。

6 . 加人大约 I O m l 含 5% 胎牛血清的 D M E M 使细胞脱落。小心吹打细胞使悬浮。

7•在 15m l 离心管中，稀释 0. 5m l 悬浮细胞到 4. 5m l 生长培养基中。吹打使完全悬浮。

8 . 加人约 IOm I 悬浮稀释细胞到血细胞计数板。

9 . 计算血细胞计数板每条边上 4m m 2 (四个角的格）的所有细胞。确定每平方毫米的细胞平均密度。用稀释倍数乘以平均密度。对结果再乘以 10⁴。这个数目相当于每毫升原细胞悬液中的细胞数。

10•根据这个细胞数，用预温的生长培养基稀释细胞到终浓度 2 X IO⁵ 个/m l 。吹打混合均匀。

11•加入 0 •5m l 含 5 % F B S 的 D M E M 到 24 孔板的每个孔内。

12.使 用 5m l 的移液器加人〇.5m l 的稀释细胞到每个孔中，最终的种板浓度为每孔 I XIO⁵ 个细胞。

13.37°C 孵育培养板过夜。

转导

14•稀释 1〜5ul 等 分 的 扩 增 病 毒 到 要 滴 定 的 350 ml 预温的含 5% FBS 的 DMEM 中。每管涡旋混合约 Is。

1 5 . 在生物安全柜中操作，无菌地从细胞中除去生长培养基。用准备的病毒悬浮液代替。

16.37°C 孵育培养板 l h 。每 15m m 轻轻摇晃板子均匀分散病毒。

17•在生物安全柜中操作，无菌地加人 400ul 预温的含 5% FBS 的 DMEM 到每个孔中。

18•在 37°C 孵育培养板 20〜48 h (取决于引导β-半乳糖苷酶转基因的扩增所在的启动子）。

转导细胞的固定

19•从培养箱中取出培养板，除去生长培养基。

这一步不需要无菌操作。

20.用 约 Iml P B S 小心清洗每个孔。

21.加入 400ul 11% 的戊二醛到每个孔中。

22•在室温孵育 l O m i n。

23.去除戊二醛。用 Iml P B S 清洗每个孔。

固定的单层细胞可以在 P B S 中 于 4°C 保存直到准备进行组织化学染色，测 定 β-半乳糖苷酶活性。