制备 B H K 包装细胞系的维持与扩大培养

制备 B H K 包装细胞系的维持与扩大培养

材料

试剂

B H K -21 细 胞（A T C C : C C L -10)

完全生长培养基

DMEM 培养液，无菌、高糖、添加 L-谷氨酸、无 S•丙酮酸 Onvitrogen 或相当的产品)

无 菌 1 0 % 胎 牛 血 清（F B S )，通过支原体测试

1 0 % 青霉素/链 霉 素（10 OOOIU/ml; Invitroge n 或相当的产品）

D u l b e c c o 磷酸盐缓冲液（D P B S ) , 无菌、无 C a 2+/M g 2+

T E (0.2 5 % 膜酶/ 0 . 0 2 % E D T A ; Invitrogen)

仪器

层流生物安全柜（Baker Steriguard II 或相当的产品）

离 心 管（conical, 15m l 和 50m l ，无菌； Corriing 或相当的产品）

临床台式离心机（I E C G P 8R C e n t r a 或相当的产品）

水洛式 C 〇 2 解 箱 [ ( 3 7 士 1.0) C ， 5 % C 〇 2; Forma 或相当的产品]

培 养 瓶（T -150，无菌； C o r n i n g 或相当的产品）

冰箱：标 准（一 20°C ) 和 超 低 温（一 80℃）

血球计数板

倒置相差显微镜（Zeiss Telaval31 或相当的产品）

医用乳胶检査手套（无粉）

微型离心管（无菌， 0. 5m l 和 I.7m l )

微型漩涡器（V W R 或相当的产品）

移 液 器 架（D r u m m o n d 或相当的产品）

移液器及无菌枪头（可调容量； Rainin P -20、 P -2 〇〇 、 P -I O O O 或相当的产品）

一次性移液管（5 m l、 IO m l 和 2 5 m l 容 积 ，无 菌）

水浴锅，（3 7 ± 1 ℃)。 ( V W R 1 2 3 5 或 相 当 的 产 品 )
方法

1.37°C 水浴预热 T E 和完全培养基。

2.接种 B H K 细胞在显微镜下检查汇合度及有无细菌或真菌污染的迹象。
细 胞 应 该 8 0 % 〜1 0 0 % 的汇合。

3.在生物安全柜内无菌操作移去并丢弃融合细胞的培养液。

4•用 5m l 无 C /M g 2+ 的 D P B S 洗细胞，丢弃洗液。

5.用 无 C a 2+Z M g 2+的 D P B S l : 1 稀释预热的胰酶，在每个细胞瓶中加人稀释过的胰酶2m l ，轻轻摇匀以均匀的覆盖单层细胞。

6.室温下或 37°C 孵育细胞瓶直到细胞分离。大约每 5m i n 观察细胞的分离情况并轻轻摇动细胞瓶使之加速分离

7.用 I O m l 预热的完全培养基冲洗 仍 附 着在瓶底部的细胞，轻柔地吹打几次重悬细胞。

8.移去 8〜I O m l 的悬浮细胞，用同样的体积悬浮第二瓶细胞， •重复直至所有的（至多 5瓶）T -150 培养瓶细胞都悬浮起来，收集所有的悬浮细胞到—个瓶子中。

9 . 吸取 I m l 的重悬细胞至 15m l 的锥形离心、管中，加人 9m l 完全培养基，轻轻吹打混合均勾

10.加大约 IOul 的稀释细胞至血球计数板上。

11.计数血球计数板每条边上（格子的四角）4m m 2 的所有细胞，确定每平方毫米的细胞平均数，乘以稀释倍数，其结果乘以 IO⁴。

此步骤阐明了富集细胞每平方毫米的数量。

12.利用上述细胞计数确定每个包装方案的种板体积。
计算的体积应该有 I.5 X I O ⁷ 个 细 胞（见 方 案 4) 。

13.将用步骤 12 决定体积中的一半把剩下的细胞次培养。