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        质 粒 D N A 的制备

        相关实验:单纯疱疹病毒 I 型来源的扩增子载体

        最新修订时间:

        材料与仪器

        步骤

        质 粒 D N A 的制备

        材料

        试剂

        琼 脂 糖(电泳级; Invitrogen 或相当的产品)

        抗生素

        氨节青霉素(100ug/ m l , Sig m a-Aldrich 公司或相当的产品)

        卡那 霉 素(lO^g/m l , S i g m a-Aldrich公司或相当的产品)

        转化有目的质粒 D N A 的 E• coli甘油保藏菌种

        内切核酸酶(N e w England Biolabs 或相当的产品)

        无水乙醇

        L B 肉 汤(E M D C h e m i c a l s 或相当的产品)

        质粒纯化试剂盒:质粒大提制备试剂盒(Bio-Rad 732-6130)

        氯化钠溶液(5m o l /L )

        T B 肉 汤(250m l ; Invitrogen或相当的产品)

        双 蒸 水(d d H 20)

        仪器

        离 心 机(Sorvall R C 5B 或相当的产品)带有 SLC-1500 的 转 头( Sorvall 或相当的产品)

        粗纱布

        临床用离心机(I E C G P 8R C e n t r a 或相当的产品)

        离 心 管(50m l ; C o m i n g 或相当的产品)

        温 控 摇 床(L a b - L i n e 或相当的产品)

        电泳胶盒(O w l 或相当的产品)

        E r l e n m e y e r 锥 形 瓶(2L 体积)

        乳胶检查手套(无粉)

        微型离心管(I.7m l A x y g e n 或相当的产品)

        Oakridge 瓶(36m l 和 250m l ; Thermo-Electron 或相当的产品

        移 液 器 架(D r u m m o n d 或相当的产品)

        移 液 枪(可调容量;Rainin P -20、 P -200、 P -I O O O 或相当的产品)

        一次性移液管(5m l 和 10m l , K i m b l e 或相当的产品)

        分光光度计(B e c k m a n D U 8 0 0 或相当的 产 品)

        带 帽 试 管(l3m m X 100m m ; V W R 或相当的产品)

        方法

        1•将加有抗生素的 3 m l 无 菌 L B 培养基置于 13m m X IO O m m 的带帽试管里,把包含有目的质粒的£•Coli菌种接种于其中, 37°C 下摇床孵育 8 h 。

        2.将步骤 1 中培养的 3m l £•coli 加 人 250m l 含有抗生素的无菌 T B 培养基中,置 于 2L的锥形瓶中在 37°C 下振荡培养过夜(16〜20 h )。

        3•在 250m l 离 心 瓶 中 置 人 250m l 培养液,在 Sorvall R C 5B 离 心 机 中 以 3795 g 离心I O m i n 获得细胞,弃上清。

        分离质粒 DNA

        此方案利用的是 BioRad Quantum Plasmid Maxiprep Kit 试剂盒,有如下修改过的步骤。

        4 . 用 15m l 重悬液重悬细菌菌粒。

        5•加人 23m l 裂解缓冲液,轻轻混勻。室 温(约 22°C ) 下静置 4m i n 。

        6•加入 15m l 的中和缓冲液,轻轻混匀,室温下静置 3m i n 。
        白色的絮状物将会变清。

        7.4°C 下 Sorvall S L C -1500 转头以 16 736 g 离心 20m i n 。

        8•将上清从一粗纱布滤人 50m l 离心管以除去细胞碎片。

        9.把步骤 8 中滤过的上清液等分置人两个 50m l 离心管中,每管加人 5m l 试剂盒里的Q u a n t u m Matrix。颠转 10 次混匀。

        10.临床用离心机室温 1290 g 离 心 5m i n 。

        11.从两管中移出上清液,用 12.5m l 清洗液重悬沉淀并合并在一个 50m l 离心管内。

        12•临床用离心机室温 1290 g 离 心 5m i n ,弃上清,用 15m l 清洗液重悬沉淀。

        13•将试剂盒中的一个离心柱放入 50m l 离心管中,将悬浮液加人离心柱中。

        14.临床用离心机室温 1290 g 离心 5m i n , 弃上清。

        15.移去离心柱并注人滤出液。

        16•加 I O m l 的洗液到离心柱中,临床用离心机室温 I290 g 离 心 5m i n 。

        17.将离心柱转入一个干净的 50m l 离 心 管(试剂盒中的),加 入 5m l 双蒸水。临床用离心机室温 1398 g 离 心 5m i n 。

        18.加人 2 倍体积的预冷 (一 20°C ) 的乙醇,并在每毫升滤出液加入 5mol/L N a C l 溶液6 〇 M l,最终达到 1 倍滤出液的体积,将它们加入 36m l 的 Oakridge 管中。

        19.S o r v a l l R C5B 转头 4°C , 20 846 g 离心 30m i n 。
        放管子的时候注意其方向。

        20•小心的移出上清液,并倒置管子,让质粒 D N A 沉淀在空气中室温下干燥 l O m i n 。

        21•向管内加人 500ul 双蒸水,盖上盖子将沉淀面向下在水平摇床上振荡过夜。

        22.S orvaIl R C 5B 转 头 4°C , 3619 g 离 心 5m i n ,把质粒 D N A 重悬液转入 I.7m l 离心管。

        23.紫外分光光度计测得 A 2S0/A 28。,计算 D N A 的浓度。

        24.用合适的限制性内切核酸酶消化 2 吨质粒 D N A , 1 % 琼脂糖胶分析限制内切核酸酶图谱。

        来源:丁香实验

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