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        多探针核糖核酸酶保护试验同时测定 mRNA 表达

        相关实验：分子生物学实验

        最新修订时间：

        材料与仪器

        步骤

         

        基 本 方 案 多 探 针 核 糖 核 酸 酶 保 护 试 验

        材 料

        R i b o Q u a n t 体 外 转 录 试 剂（B D Pharmingen) 包含下面：
        40U /ul RNasin

        G A C U 库（2.75m m o l / L G T P /2.75m m o l / L A T P / 2.75m m o l / L C T P /61/xmol/L U T P )

        100m m o l / L D T T

        5 X 转录缓冲液

        20U / 4 T 7 R N A 聚合酶
         

        lU/ul 无 R N a s e 的 D N a s e

        20m m o l / L E D T A

        4m o l / L 乙酸铵

        D E P C 水
        5〜10ng/jul的 R i b o Q u a n t 多 探 针 模 板 （B D P h a r m i n g e n ) 和 （或）常 规 模 板 （见 辅助方案1) 3000Ci/ m m o l [33P ] U T P (N e w E n g l a n d N u c l e a r ) 或 [32P ] U T P A m e r s h a m MicroSpin G 25 柱 Scintillation液 （用于33P 标记的探针） 总 R N A (CPI 单元 10. 11) R P A 试 剂 盒 （B D Pharmingen) 包含： I X 杂交缓冲液 2m g / m l 酵母 t R N A I X R N a s e 缓冲液 R N a s e A 和 T l 的 混 合 液 （80ng/M l R N a s e A ， 250U /M1 R N a s e T l ) I X 蛋 白 酶 K 缓冲液 10m g /m l 蛋 白 酶 K 4m o l/L 乙酸铵 矿物油 R N a s e 灭活/ P P T 试剂 III (A m b i o n ) 1 0 0 % 乙醇 GlycoBlue 共 沉 淀 剂 （A m b i o n ) 0. 5m l 和 1.5m l 微量离心管，无菌 1.5m l 和 2. 2m l 微量离心管 Geiger计数校准器，用于32P 和 （或)33P 液闪小瓶
        可 调 加 热 块 （如 BoekeD 棉签，无菌 1 . 在一个无菌微离心管中加入： Ijul 4〇 U/]ul RNasin Ifxl G A C U pool 2/xl l O O m m o l / L D T T 4M1 5 X 转录缓冲液 2 D E P C 水 1/jil R i b o Q u a n t 多 探 针 模 板 和 （或）常 规 模 板 （5〜IOng) 8M l 3000Ci/mmol [33P ] U T P 或 [32P ] U T P IfJ 20U//xl T 7 R N A 聚合酶。 标记反应时，可以在B D P h a r m i n g e n 多探针模板中加入额外的常规探针，每个 探 针 有 5〜I O n g 被合成就足够了。 2 . 在微量离心管中，轻轻充分混勻，室温下最大速度瞬时离心。 37°C 孵 育 90m i n 。 3 . 加 入 2M l l U //xl的 无 R N a s e 的 D N a s e 1，轻轻充分混勻。室温下最大速度瞬时离心， 37°C 孵育 30m i n 。 4•加入 2jud 的 2m g / m l 的酵母 t R N A 和 22M1 20m m o l / L E D T A ，吹打混匀。 酵 母 t R N A 可从其他途径购买，但是使用前再次用苯酚/氯仿提取，沉淀后用无 R N a s e 的水重悬必不可少。 5•将一根A m e r s h a m MicroSpin G 2 5 的柱子放入2. 2m l 的微量离心管中室温， 735g 离 心 l m i n ，以去柱中缓冲液。将柱子转移到新的1.5m l 的管子中，加 入 44/xl合成反应 液 ，室温， 735g 离 心 2m i n 。 6a. 33P 标记的探针：加 入 2m l 闪烁液到一个合适的小瓶中，加 入 1M 1 洗涤过的探针， 在闪烁计数器上确定c p m 。 6b. 33P 标记的探针：加 入 1/ul洗涤过的探针到液闪小瓶中，在闪烁计数器上确定 c p m (如 Cerenkov counting)。 在指定闪烁计数器上，有无闪烁的标记探针的 c p m 比值必须知道，这个比值 每 6 个月检查一次。 另外， 2m l 闪液可以加到32P 标记的探针中去。 7. 1〜10M g 从单个样品中分离的总靶R N A 到 0. 5m l 微量离心管中。 如 果 R N A 的量是有限的， R N A 可 以 直 接 稀 释 到 用 于 检 测 每 一 个 探 针 的 8 〜 10^x1杂交缓冲液中。 R N A 可以一70°C 保存在杂交缓冲液中。 8•—个 cocktail，放 入 12〜14/xl杂交缓冲液到0.5X 106〜I X l O 6c p m 33P 标记的探针。 9 . 加人等体积的杂交缓冲液/探 针 cocktail到 每 一 个 R N A 样 品 中 （步 骤 7)。上下吹打 3〜5 次混匀。另被两个对照管分别加入探针和杂交液，但不加 R N A 样品。 10.预热加热装置到90°C 。每个管子中加入一滴矿物油，并将其放入加热装置中。 90°C 下孵育5m i n，然后将加热装置转移到56°C 让样品慢慢冷却，在这个温度下孵育过夜。 11. 37°C 下孵育 10〜15m i n 。 如 果 用 [33P ] O T P 标记探针，杂 交 后 的 cocktail应保存在一70°C 过夜 ，第二
        天 用 R N A 酶 处 理 。 12.加 入 100/xl I X R N a s e 缓冲液到对照管，其中含有加入的探针但无样品R N A 。 13•准备2.5ml R N a s e 缓冲液和6^1 R N a s e A + T 1 的混合液。加 入 IOOi ^r 混合液到每一 个杂交反应中，包括另一个对照（步 骤 9 ) 。 用手指弹勻溶液，不能用涡旋混勻器。 室温， 2000r/min 离心 30s。 30°C下鮮育 45min。 14•当R N A 样品正被 消 化 时 ，准 备 足 够 的 灭 活 消 化 液 的 cocktail，以如下配方作为 指南： 200]ul RNase 灭活/PPT 试剂 III 5〇 4 1 0 0 % 乙醇 5/xg 2mg/ml 酵母 t R N A I.5jul GycoBlue共沉淀剂，全部混勻。 涡旋混勻，加 人 250M1 cocktail到 I.5m l 无菌微量离心管中。 15.移出矿物油下的样品（步 骤 13)，加入灭活 cocktail，颠 倒 3 或 4 次混合均勻，不要 用涡旋混匀器 ， 一 7〇 °C 下孵育样品15m i n 。 作 为 一 个 灭 活 /沉 淀 方 法 的 备 选 方 案 ，可 用 蛋 白 酶 K 灭 活 RNase， R N A 也可在 无 苯 酚 / 氯 仿 提 取 下 直 接 沉 淀 。 16•室温， 14 00 0r/min离心样品15min。 小心倒除放射性的上清，用无菌棉签除去管壁 过多的液体，小心蓝色沉淀物。 17•用3/zl上样缓冲液上下吹打5〜1 0 次 ，重悬沉淀物。用凝胶电泳和放射自显影分析 (见辅助方案2)。 见表 14. 9. 1 。 表 1 4 . 9 . 1 多 探针 R P A 分析法的问题解决方案 问题 可能原因 解决方法 模板未被标记 UTP含有抑制T7聚合酶的染料 用无染料的UTP重复试验 T 7 聚合酶失效 用新鲜的聚合酶 模板被降解 获取新的模板 离心设置和体积不匹配，使被探针标记的位 提高转速再次离心 点未被分离出 胶上无被保护条带 RNA酶没有被适当灭活和移除 检 査 加 入RNA酶 缓 冲 液 的RNA酶的体 积和每管中加入灭活/ 沉 淀 溶 液 的 体 积 。 如果使用了蛋白酶K，换用一罐新酶 没有被保护条带，但有 目的基因少或无表达 增加胶的曝光时间使被保护条带可见 L32 和 GAPDH 带 条 带 出 现 在 和 未 消 化 如果条带出现在每条探针相同的位置，说明 RNA酶重新消化 的探针相同的位置 RNA酶没有起作用（图 10.29. 6)a 分析看似有结果，但有 没 用 DNA酶消化或未起作用b 用 新 鲜DNA酶重复实验 很 多 非 保 护 探 针 相 应 的条带 整 张 胶 分 布 有 许 多 被 RNA被 部 分 降 解 或 RNA制 备 中 有 DNA 制备新的RNA并 用 DNA酶处理 保护条带 污染
        问题 可能原因 解决方法 胶未聚合 AP失效 制 备 新 鲜AP 胶 不 能 轻 松 从 玻 璃 板 上剥下 板不洁净或未经硅化处理 用 2mol/L NaOH清洁板并硅化或重新硅 化 (见辅助方案2) 条 带 在 胶 底 部 不 正 常 迁移 跑胶设备有缓冲液渗漏 检査封闭垫圈 出 现 与 期望保护条带 大小不一致的条带 核苷酸多态性导致了目的条带的分裂。 污 染 DNA导致 被 消 化 探 针 的 残 留 部 分 与 DNA外显子部分杂交 从探针提供者处获取RNA保护区的序列 分 析 DNA的多态性 使 用 前 用DNA酶 处 理 RNA，并确定在进 行下个操作前将之移除/ 灭 活 。或 者 ，用 Trizol重 新 提 取RNA，并避免纯化中移去 液化层时碰到界面 a . 注意一些被保护条带可能与另一非保护探针条带出现在同一位置。 b . 这可能导致探针与未消化模板杂交，但由于探针过量，也可能发生与RNA的杂交。 c . 尽管保护探针中部的单核苷酸多态性很少被RNA酶裂解，多态性> 2 个核苷酸可能引起被保护条带的裂解， 导致胶上出现较小条带。 辅 助 方 案 1 构建一个核糖探针模板 核 糖 探 针 模 板 （R P T ) 由 T 7 聚合酶先导序列和反义靶c D N A 构成。核糖探针是由 T 7 聚合酶转录来的区域，包 括 靶 c D N A 和 任 何 载 体 衍 生 的 序 列 （图 14. 9. 2)。只要有 可能，靶序列最好能跨越至少两个外显子，以产生一个对n i R N A 特异的探针，但不污 染基因组 D N A 。区域应该高度保守，尤其是处理不同种系的动物时。只要有一对碱基 错配就可以产生未期望得到的长度的保护条带。被扩增产物的长度最好在1〇〇 〜450b p ， 以确保全长的转录物和具体条带的分离。确保从多探针模板来的扩增产物有不同的大 小 ，以便实验中的每个探针可以分辨 w a r e ; http://w w w .sci.ed.c o m ) 这样的程序使得这个过程变得很容易。 材 料 （带V 项 目 见 附 录 1) 靶 c D N A SuperScript—步 R T - P C R 试 剂 （Invitrogen; 可选） 引物： 感兴趣序列的正向引物（如 Invitrogen， Operon) T 7 聚 合 酶 引 物 （如 Invitrogen， Operon) 合适的宿主菌株 V 有合适选择性的L B 平板 Invitrogen Platinum P C R Supermix D N A ladder (如 D N A 低分子质量 ladder， Invitrogen) 旋 转 柱 （如 GenElute Minus EtBr 旋转柱， Sigma) 5mo l / L 乙酸铵， p H 5.3，或 3m o l / L 乙酸钠， p H 5.5
        1 0 0 % 乙醇 70% (W V ) 乙醇， 4°C T7 R N A 聚合酶/RNase 抑制剂 Maxiscript (Ambion) 枪头，无菌 94°C水浴或者加热装置 1•用传统方法RT-PCR扩 增 靶 cDNA (如 单 元 14. 5 Superscript —步 RT-PCR试剂 盒），用感兴趣序列的正义引物和T7 或 T3 聚合酶引物。 设 计 一 个 特 定 的 探 针 ，如 果 这 个 探 针 要 被 直 接 加 入 到 商 业 化 的 探 针 中 。 2•用传统方法克隆扩增靶序列反义引物区，形成一个核糖探针模板（RPT) (如 T A 或 者 Zero Blunt TOPO Cloning试剂盒）和一个合适的载体（如 PCR 4 克隆载体）。转 化到适合的宿主菌株（如 CPI附录3N)，在有合适选择性的LB平板上培养。 选 择 一 个 合 适 的 克 隆 载 体 时 ，需 要 考 虑 三 个 因 素 ：① 克 隆 容 易 ；② T 7 聚合酶启 动 子 上 游 的 限 制 性 ， 它 将 允 许 R P T 能 够 从 载 体 上 切 割 下 来 ；③ 选 择 近 T 7 转 录 起 始 处 克 隆 c D N A 。非 c D N A 序 列 应 配 对 ， 以 便 它 们 作 为 探 针 标 记 的 时 候 不 会 重 叠 。 3•用无菌枪头挑取一个克隆，轻轻地涂在有合适选择性的LB平板上，用于进一步的扩 增和克隆质粒的纯化。然后用20〜50jul Invitrogen Platinum P C R Supermix祸旋洗枪 头 ， 94°C孵 育 5m i n 使细菌裂解。
        4 . 用如下的P C R 程序扩增: 起始步骤： 5min 94〇C 变性 30〜3 5 循环： 30s 94〇C 变性 30s 600C 复性 30s 68°C 延伸 最终步骤： 8〜 IOmin 68〇C 延伸 无限制 4°C 保持。 5. 1 0 个以上的克隆， P C R 扩增，并 取 10〜30/xl P C R 反应液分析， D N A 序列分析，校 验方向和序列。 6 . 用合 适 的 限 制 酶 （如:SnaBI) 消化 含 R P T 的载体，释 放 P R T 。 7 . 在含 有 D N A ladder的琼脂糖凝胶上电泳分离酶切下来的R P T 。切 下 含 有 R P T 的琼 脂糖凝胶条带，用旋转柱或相应技术纯化R P T 。 不 要 将 切 下 来 的 胶 在 U V 下 曝 光 过 长 时 间 。 U V 光 会 导 致 D N A 破 坏 。 8 . 加 人 1 / 1 0 体 积 的 5mol/L 乙酸铵， p H 5 . 3 或 者 3mo l/L 乙 酸 钠 ， p H 5. 5 和 2 体积 100%的 乙 醇 。一20。 ( ：下孵育10111丨11。 4°〇， 14 00(^离心10111丨11并收集沉淀。用足够 的 D E P C 处理水重悬溶解含R P T 的沉淀。 55°C 下 孵 育 I O m i n 溶 解 D N A 。 9 . 用 一 个 C C D 照相机和分析软件定量检测在琼脂糖凝胶上纯化的探针。 辅 助 方 案 2 凝胶电泳和结果的可视化 一个标准的3 0 道 的 D N A 测序胶可用于分离被保护的探针。利用多探针模板系列 时 ，保护探针的大小可为1〇〇 〜400个核苷酸。样品必须加热到90°C 使 得 R N A 在上样 前变性。电泳之后，胶被烘干，然后在一 70°C 下曝光到胶片上。 作为一个备选方案来制备测序胶， U S B 的 Gel-Mix 6 或 者 8 是非常好用于检测 R P A 的胶混合液的商业化的软件。为了使多聚化更快，现 配 的 1 0 % 的 过 硫 酸 铵 （A P S ) 应该每隔2〜4 周准备一次。为了使胶能够从玻璃板上分离下来，一块玻璃板应该在灌 胶前硅化。如果玻璃板保存得很好，并且每做7〜1 0 块胶后，用 2mo l/L 的 N a O H 浸泡 20m i n ，胶灌起来会很容易。灌胶时有一个小的角度也会使灌胶变得容易，新配的胶应 该在放平后多聚化至少20m i n 。 用标准长度的微毛细枪头上样是非常方便的。用上样缓冲液稀释含有未消化探针 (如 不 含 R N a s e ) 的第二个对照管，使 得 每 Im I含 有 50 000〜60 O O O c p m ，从而条带密度 在一个比较合理的水平上。 R P A 胶应该直接放在胶片上曝光过夜。如果每 道 用 l〇Mg 总 R N A ， 要达到可以出 版的质量一般需要曝光4 〜 6h 。 如果用33P ， BioMax M S 胶 片 （V W R ) 应 该 放 在 T m n - Screen-LE Intensifying Screen (V W R ) 里面，后者在盒子里面以加强33P 在胶片上的曝 光效果。由于这种胶片极度敏感，所以在用该种胶片时暗房里不应该有一点光线，包括 电脑检测仪和安全光。另外，如果需要条带定量，胶应该放在磷相仪中过夜，并用合适 的 系 统 扫 描 （如 Molecular Dynamics Typhoon system) 。 用多探针模板系列，粑基因应 该 相 对 L 3 2 核糖体 R N A 和 （或） G A P D H 定量。 G A P D H 的水平会根据实验条件而发 生变化
         

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        来源：丁香实验

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