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        核糖核酸探针

        互联网

        1787

         

        核糖核酸探针

         

        1. 室温下,于 1.5ml 无菌微量离心管内依次加入:

        5 μ l               5 ×转录缓冲液

        1 μ g               模板 DNA

        1.2 μ l             10 mmol/L rATP (终浓度为 480 μ mol/L

        1.2 μ l             10 mmol/L rCTP (终浓度为 480 μ mol/L

        1.2 μ l             10 mmol/L rGTP (终浓度为 480 μ mol/L

        1 μ l               1 mmol/L UTP (终浓度为 40 μ mol/L

        1 μ l               0.75 mol/L 二硫苏糖醇

        1 μ l               RNase Block Ⅱ或 0.5 μ l RNasin

        5 μ l               α -[32 P]UTP 2.5 μ mol/L 终浓度, DEPC 水加至 25 μ l

        1 μ l               T3, T7 SP6 RNA 聚合酶( 10U

        2. 37 40 ℃温育 60min

        3. 若不做凝胶纯化步骤,则:

        a.       加入 1 μ l 无核糖核酸酶的脱氧核糖核酸酶并在 37 ℃温育 15min

        b.      DEPC 处理水将体积增至 100 μ l 。加 100 μ l 苯酚:氯仿:异戊醇( 25 24 1 )溶液再提取一次。

        c.       再加入 100 μ l 氯仿:异戊醇( 24 1 )溶液再提取一次。

        d.      0.5 倍体积 7.5mol/L 乙酸铵及 2 倍体积乙醇,置干冰中 30min

        e.       10 000 × g 离心至少 5 min (去除上清液并用盖革计数器监控)。

        f.        100 μ l 1mol/L 乙酸铵重悬沉淀小团,重复 d e 步骤。

        g.       真空(真空旋转蒸发 / 浓缩仪)干燥沉淀小团,用 DEPC 水重悬沉淀小团,取 1 μ l 置液闪仪计数。

        4. 若需做凝胶纯化,则:

        a.       将无 RQ1 RNA 酶的 DNA 酶处理步骤省去。

        b.      制备测序凝胶( 5 %聚丙烯酰胺 /6mol/L 尿素)

        c.       DEPC 水将核糖核酸探针溶液体积增加至 100 μ l 100 μ l 苯酚:氯仿:异戊醇( 25 24 1 )溶液提取一次, 100 μ l 氯仿:异戊醇( 24 1 )再提取一次。

        d.      0.5 倍体积 7.5mol/L 乙酸铵,加 2 倍体积乙醇置干冰 30 分钟。

        e.       10 000 × g 离心至少 5min (去除上清液,并用盖革计数仪监控),真空干燥,用 5 μ l DEPC 水重悬沉淀。

        f.        10 μ l 上样缓冲液,全部的样品上样电泳(样品上样前加热到 85 5min 即置入冰中),在 60W 条件下至少电泳 1.5h

        g.       去除玻璃板,用塑料薄膜包裹凝胶, X 射线胶片曝光 30 60s ,核糖核酸探针所处位置呈现自显影像,用剃须刀准确切下相应凝胶条带。

        h.       凝胶条用 400 μ l 洗脱缓冲液, 37 ℃下,连续振荡洗脱 4h 。洗脱液移入干净离心管,盖革计数器检测洗脱液及凝胶条块(洗脱液中计数值应高于凝胶条)。

        i.         1 μ l 冰冷乙醇并静置冰浴 15min

        j.        10 000 × g 离心 15min ,乙醇沉淀。 RNA 沉淀用 DEPC 水再溶解,取 1 μ l 置液闪仪计数。

         

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