凝胶蛋白质激酶分析

1. 准备下列材料：

SDS-PAGE 要用到的所有试剂

50 mmol/L Tris-HCl，室温（pH 8.0)，1 mmol/L DTT

6 mol/L 盐酸胍，50 mmol/L Tris-HCl，室温（pH 8.0），1 mmol/L DTT

8 mol/L 尿素，50 mmol/L Tris-HCl，室温（pH 8.0)，1 mmol/L DTT

50 mmol/L Tris-HCl，4℃ 时（pH 8.0)，1 mmol/L DTT，0.05% Tween-20

5% TCA 溶液（w/v）

适宜的激酶分析缓冲液

ATP 储存液

[γ-³²P] ATP（3000 Ci/mmol）

2. 配制合适的丙烯酰胺浓度的聚丙烯酰胺凝胶溶液。往凝胶混合物中加入 10X 激酶底物储存液至终浓度 1 mg/ml。灌胶，按常规方法聚合。

3. 制备 SDS-PAGE 用的蛋白质样品，加样，开始电泳。

4. 电泳结束后，放入 200 ml 含 20% 丙醇的 50 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0），1 mmol/L DTT 中。冲洗 20 分钟，然后用新鲜缓冲液再同样冲洗两次。

5. 用 50 mmol/L Tris-HCl ( pH 8.0)，1 mmol/L DTT 冲洗凝胶 3 次，每次 20 分钟。

6. 用含 1 mmol/L DTT 的 50 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）溶解的 6 mol/L 盐酸胍、或 8 mol/L 尿素清洗凝胶。洗两次，每次 250 ml，3 分钟。

7. 于 4℃，18 个小时内，用 250 ml 含 1 mmol/L DTT 和 0.05% Tween-20 的 50 mmol/L Tris-HCl ( pH 8.0) 清洗凝胶 8 到 10 次，以使蛋白质复性。

8. 用 250 ml 无 ATP 但有 Mg²⁺ 的适宜的激酶分析缓冲液孵育凝胶。于 30℃ 孵育 20 分钟。

9. 吸干缓冲液，将凝胶放在一个小盘子或热封式塑料袋里，准备进行放射性实验。加入尽量少的激酶分析缓冲液，使得刚好盖住凝胶。加入 ATP 储存液至终浓度 50 μmol/L 与 20 μCi/ml [γ-³²P] ATP 。

10. 第一次尝试于 30℃ 孵育 1 小时。

11. 用 250 ml 5% TCA 浸泡凝胶 2 次，每次 15 分钟，然后用 500 ml 含有 1% 焦磷酸钠的 5% TCA 浸泡凝胶。冲洗凝胶，直至溶液不再有放射性。

12. 将凝胶放在滤纸上晾干，放射自显影。