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        向平末端DNA连接合成接头实验

        相关实验:向平末端 DNA 连接合成接头实验

        最新修订时间:

        原理

        接头是指合成的能够自身互补的 DNA 片段,一般长 8~16 个核苷酸,互补的片段复性后可形成平末端的含有一个酶切位点的双链分子。

        材料与仪器

        步骤

        一、材料

        1. 缓冲液和溶液

        乙酸胺(4 mol/L,pH 4.8),ATP ( 5 mmol/L 和 10 mmol/L)(如果连接缓冲液中已有 ATP,则在步骤 2 中省去添加 5 mmol/L ATP),乙醇,10X 接头激酶缓冲液(600 mmol/L Tris-Cl ( pH 7.6),100 mmol/L MgCl2,100 mmol/L 二硫苏糖醇(DTT),2 mg/ml 牛血清白蛋白(BSA)),苯酚:氯仿(1:1,V/V),乙酸钠(3 mol/L,pH 5.2),TE ( pH 8.0)。

        2. 酶和缓冲液

        T4 噬菌体连接酶,T4 噬菌体多聚核苷酸激酶,限制性内切核酸酶。

        3. 凝胶

        10% 聚丙烯酰胺凝胶,或 0.7% 琼脂糖凝胶。

        4. 核酸和寡核苷酸

        外源或目的 DNA 片段(平末端),人工合成的接头,TE 溶解,浓度为 400 μg/ml。

        5. 放射性标记物

        [ y-32P] ATP(1~10 μCi)。

        6. 专用设备

        柱旋转层析装置,温度可调至 65℃ 的水浴装置。

        二、方法

        1. 接头的磷酸化(如需要)

        (1) 在一个无菌的 0.5 ml 离心管中加入下列反应混合物:10X 接头激酶缓冲液 1.0 μl,10 mmol/L ATP 1.0 μl,人工合成的接头 [ TE ( pH 8.0) 溶解 ] 2.0 μg,H2O 补至 9 μl,T4 噬菌体多聚核苷酸激酶 10 单位,12 个碱基的接头约 250 pmol,反应物于 37℃ 温育 1 h。

        如有必要,此时应进行目的 DNA 内部酶切位点的甲基化。甲基化处理按销售者的指导在连接接头之前完成。

        2. 磷酸化接头与 DNA 平末端的连接

        (1) 计算 DNA 平末端在制备物中的浓度,然后在一个 0.5 ml 离心管中加入下列连接反应混合物:50 μg 的 1 kb 长双链 DNA 片段=78.7 nmol 或 157.4 nmol/L 的末端;平末端 DNA 2 pmol 末端;磷酸化接头 150~200 pmol 末端;H2O 补至 7.5 μl;10X 连接酶缓冲液 1.0 μl;5 mmol/L ATP 1.0 μl;T4 噬菌体 DNA 连接酶 1.0 Weiss 单位。

        反应混合物于 4℃ 温育 12~16 h。

        (2) 反应混合物于 65℃ 温育 15 min 以灭活 T4 噬菌体 DNA 连接酶。

        (3) 让连接反应混合物冷至室温,然后加入:10x 内切酶缓冲液 10 μl;限制性内切核酸酶 50 单位;灭菌水补至 100 μl。

        反应物于 37℃ 温育 1~3 h。

        3. 连接产物(DNA)的回收

        (1) 用苯酚:氯仿抽提纯化出酶切 DNA 片段,然后加乙酸胺(终浓度为 2 mol/L),再加 2 倍体积的乙醇以沉淀 DNA。

        (2) 于 4℃ 用微量离心机高速离心 15 min 收集 DNA 沉淀,加 50 μl TE ( pH 8.0) 溶解沉淀。

        (3) DNA 溶液通过离心层析柱以除去过量的接头。

        (4) 用乙醇沉淀回收 DNA,而后用 10~20 μl TE ( pH 8.0) 重新溶解沉淀。

        经过修饰的 DNA 片段现在可以连入质粒(或噬菌体)载体(它们凸出末端与 DNA 片段由接头引入的序列互补)。

        来源:丁香实验

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