材料与仪器
步骤
一、材料
1. 缓冲液、溶液和试剂
1.5% 琼脂糖凝胶，加溴化乙锭 (见第 9 步）
蒸馏水
DNA 点样染料
30% 甘油
70% 蒸馏水
0.003% 溴酚蓝
0.003% 二甲苯腈 FF(GenHunterS403)
溴化乙锭溶液（0.5ug/ml)
蒸馏水
重新扩增混合液（见第 7 步）
2. 核酸和寡核苷酸
任意引物（H-AP)(2 mmol/L)
cDNA(切割的条带），来自方案 5
dNTP 混合液（250umol/L)(GenHunterS501)
未标记的锚定引物（H-T11M)(2umol/L)
载体特异性引物 [Lseq/Rseq(GenHunter)]
3. 酶和酶缓冲液
10XPCR 缓冲液
100 mmol/LTris-HCl,pH8.4
500 mmol/LKCl
15 mmol/LMgCl2
0.01% 明胶
TaqDNA 聚合酶（Qiagen201207)
4. 专用设备
电泳装置
1.5 ml 离心管
Parafilm
热循环仪
0.2 ml 薄壁 PCR 管（GenHunterT101)
UV 透射仪
微波炉
5. 附加试剂
PCR-TRAPCloningSystem(GenHunterP404), 包括准备好插入的 PCR-TRAP 克隆载体、T4DNA 连接酶（200u/ul)、蒸馏水、10X 连接缓冲液（500 mmol/LTris-HCl、pH7.8,100mmol/LMgCl2，100nimol/LDTT，10 mmol/LATP，500ul/mlBSA) 和GH-competent RNA spectra Fluorescent mRNA 差异显示系统（GenHunterF501-F510R501-R510，或者S201)
6. 细胞
GH-competent 细胞
7. 特别项目
含有抗生素的琼脂平板（参考克隆系统推荐的专用抗生素与方案）
二、方法
1. 将方案 5 中切下的条带，放到 1.5 ml 离心管中，加入 1ml 蒸馏水。
2. 浸泡 30 min，时常涡旋混匀。
3. 除去蒸馏水（不要丟掉条带），再加入 50ul 新鲜的蒸馏水。
4. 将离心管盖紧（用 Parafilm 封住），煮沸 15 min，将 cDNA 从凝胶中洗提出来。
5. 离心 lmin，浓缩并收集凝胶。
6. 将上清液转移到一个新的 1.5 ml 离心管中，弃去装有凝胶的管子。
7. 在 0.2 ml 薄壁 PCR 管中，加入下列组分完成 cDNA 的重新扩增。
蒸馏水 22.6ul
10XPCR 缓冲液 4.0ul
dNTP 混合液（250umol/L) 1.0ul
H-AP 引物（2umol/L) 4.0ul
H-T11M(2umol/L) 4.0ul
cDNA 模板 4.0ul
Taq DNA 聚合酶 0.4ul
8. 将重新扩增的反应液放在热循环仪上，以最初 PCR 条件（见方案 4 第 1 步）进行反应。
9. 配制含有溴化乙锭的 1.5% 琼脂糖凝胶。
a. 在玻璃烧瓶中，称 1.5 mg 超纯的电泳级琼脂糖。
b. 加 1XTAE 至 100 ml。
c. 将琼脂糖放到微波炉中熔化。
d. 冷却后，加入 3ul1:1 的溴化乙锭溶液。
e. 混匀后，倒入凝胶装置中。
f. 放好梳子，等胶凝固。
g. 电泳缓冲液为 1XTAE 溶液（凝胶装置不同，用量也不同）。
10. 在 0.5 ml 的离心管中，加入 30ul 的再扩增反应液和 5ul DNA 点样染料。将混合液全部加到 1.5% 琼脂糖凝胶上。
11. 在 70V 电压下电泳大约 45 min。
12. 用 UV 透射仪进行观察，以确认 cDNA 再扩增反应产物。
13. 按照厂商给的方案，将差异表达的 cDNA 克隆到推荐的 PCR-TRAP 克隆载体或其他合适的载体中。
14. 如果使用的是 PCR-TRAPCloningSystem，可以使用提供的载体特异性引物进行测序。如果使用其他的克隆载体，请参考厂商的测序说明书。
1. 缓冲液、溶液和试剂
1.5% 琼脂糖凝胶，加溴化乙锭 (见第 9 步）
蒸馏水
DNA 点样染料
30% 甘油
70% 蒸馏水
0.003% 溴酚蓝
0.003% 二甲苯腈 FF(GenHunterS403)
溴化乙锭溶液（0.5ug/ml)
蒸馏水
重新扩增混合液（见第 7 步）
2. 核酸和寡核苷酸
任意引物（H-AP)(2 mmol/L)
cDNA(切割的条带），来自方案 5
dNTP 混合液（250umol/L)(GenHunterS501)
未标记的锚定引物（H-T11M)(2umol/L)
载体特异性引物 [Lseq/Rseq(GenHunter)]
3. 酶和酶缓冲液
10XPCR 缓冲液
100 mmol/LTris-HCl,pH8.4
500 mmol/LKCl
15 mmol/LMgCl2
0.01% 明胶
TaqDNA 聚合酶（Qiagen201207)
4. 专用设备
电泳装置
1.5 ml 离心管
Parafilm
热循环仪
0.2 ml 薄壁 PCR 管（GenHunterT101)
UV 透射仪
微波炉
5. 附加试剂
PCR-TRAPCloningSystem(GenHunterP404), 包括准备好插入的 PCR-TRAP 克隆载体、T4DNA 连接酶（200u/ul)、蒸馏水、10X 连接缓冲液（500 mmol/LTris-HCl、pH7.8,100mmol/LMgCl2，100nimol/LDTT，10 mmol/LATP，500ul/mlBSA) 和GH-competent RNA spectra Fluorescent mRNA 差异显示系统（GenHunterF501-F510R501-R510，或者S201)
6. 细胞
GH-competent 细胞
7. 特别项目
含有抗生素的琼脂平板（参考克隆系统推荐的专用抗生素与方案）
二、方法
1. 将方案 5 中切下的条带，放到 1.5 ml 离心管中，加入 1ml 蒸馏水。
2. 浸泡 30 min，时常涡旋混匀。
3. 除去蒸馏水（不要丟掉条带），再加入 50ul 新鲜的蒸馏水。
4. 将离心管盖紧（用 Parafilm 封住），煮沸 15 min，将 cDNA 从凝胶中洗提出来。
5. 离心 lmin，浓缩并收集凝胶。
6. 将上清液转移到一个新的 1.5 ml 离心管中，弃去装有凝胶的管子。
7. 在 0.2 ml 薄壁 PCR 管中，加入下列组分完成 cDNA 的重新扩增。
蒸馏水 22.6ul
10XPCR 缓冲液 4.0ul
dNTP 混合液（250umol/L) 1.0ul
H-AP 引物（2umol/L) 4.0ul
H-T11M(2umol/L) 4.0ul
cDNA 模板 4.0ul
Taq DNA 聚合酶 0.4ul
8. 将重新扩增的反应液放在热循环仪上，以最初 PCR 条件（见方案 4 第 1 步）进行反应。
9. 配制含有溴化乙锭的 1.5% 琼脂糖凝胶。
a. 在玻璃烧瓶中，称 1.5 mg 超纯的电泳级琼脂糖。
b. 加 1XTAE 至 100 ml。
c. 将琼脂糖放到微波炉中熔化。
d. 冷却后，加入 3ul1:1 的溴化乙锭溶液。
e. 混匀后，倒入凝胶装置中。
f. 放好梳子，等胶凝固。
g. 电泳缓冲液为 1XTAE 溶液（凝胶装置不同，用量也不同）。
10. 在 0.5 ml 的离心管中，加入 30ul 的再扩增反应液和 5ul DNA 点样染料。将混合液全部加到 1.5% 琼脂糖凝胶上。
11. 在 70V 电压下电泳大约 45 min。
12. 用 UV 透射仪进行观察，以确认 cDNA 再扩增反应产物。
13. 按照厂商给的方案，将差异表达的 cDNA 克隆到推荐的 PCR-TRAP 克隆载体或其他合适的载体中。
14. 如果使用的是 PCR-TRAPCloningSystem，可以使用提供的载体特异性引物进行测序。如果使用其他的克隆载体，请参考厂商的测序说明书。
来源：丁香实验
