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        PCR 扩増实验

        最新修订时间:

        材料与仪器

        步骤

        一、材料

        1. 缓冲液、溶液和试剂

        去除 RNA 酶的双蒸水

        10XRT-PCR 缓冲液(100 mmol/LTris-HCl、pH8.3,500 mmol/LKC1,15 mmol/LMgCl2)

        2. 酶和酶缓冲液

        TaqDNA 聚合酶(5U/ul)

        3. 核酸和寡核苷酸

        dNTP 混合物(10 mmol/L,包含所有四种 dNTP)

        基因特异的正向引物(5umol/L)

        基因特异的反向引物(5umol/L)

        单链 cDNA(见第一部分)

        4. 放射性复合物

        [a-32P]dCTP(10uCi/ul)(lCi=37 GBq)

        5. 实验器材

        薄壁的 PCR 管

        6. 专用仪器

        可编程的 PCR 仪

        二、方法

        1. 准备 PCR 反应混合物。

        由第一部分制得的 cDNA                      11ul

        10XRT-PCR 缓冲液                              55ul

        10 mmol/LdNTP 混合物                        44ul

        5umol/L 基因特异的正向引物               22ul

        5umol/L 基因特异的反向引物               22ul

        5U/ulTaqDNA 聚合酶                            2.75ul

        去除 RNA 酶的双蒸水                           387.75ul

        [a-32P]dCTP(10uCi/ul)                         5.5ul

        2. 平均 50ulPCR 反应混合物分别放入 10 个薄壁 PCR 管中。

        3. 带有热盖的适当的 PCR 仪(如:GeneAmpPCRSystem9700,AppliedBioSystems)

        上运行 PCR。PCR 扩增的循环参数如下。

        94°C30s

        退火温度 30s

        72°C30s

        35 个循环

        4. 每次奇数脉冲循环后放在冰上取样,由第 15 个循环起始,到第 35 个循环终止。

        5. 变性聚丙烯酰胺凝肢(6% 丙烯酰胺/8mol/L 尿素)上分析样品。每个样品上样

        10ul。滤纸上干燥凝肢,用 Phosphorlmager 或 X 射线片和 densitometer 对产物定量,也可以将产物条带从凝胶上切下,通过闪烁记数仪定量。

        6. 信号的对数(y 轴)对应循环数(x 轴)作图。选择处于线性范围中心的循环数在后

        续实验中使用。

        来源:丁香实验

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