原理
常用来分离人外周血单个核细胞（PBMC）的分层液比重是 1.077±0.001 的 聚 蔗糖（Ficoll）-泛影葡胺（Urografin）（F/H）分层液。Ficoll是蔗糖的多聚体，呈中性，水性高，平均分子量为400000，当密度为1.2 g/ml仍未超出正常生理性渗透压，也不穿过生物膜。红细胞、粒细胞比重大，离心后沉于管底；淋巴细胞和单核细胞的比重小于或等于分层液比重，离心后漂浮于分层液的液面上，也可有少部分细胞悬浮在分层液中。吸取分层液液面的细胞，就可从外周血中分离到单个核细胞。
材料与仪器
步骤
1. 在短中管中加入适量淋巴细胞分离液。
2. 取肝素抗凝静脉血与等量Hank's液或RPMI1640充分混匀，用滴管沿管壁缓慢叠加于分层液面上，注意保持清楚的界面。水平离心2000 rpm×20 分钟。
3. 离心后管内分为三层，上层为血浆和Hank's液，下层主要为红细胞和粒细胞。中层为淋巴细胞分离液，在上、中层界面处有一以单个核细胞为主的白色云雾层狭窄带，单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞。此外，还含有血小板。
4. 用毛细血管插到云雾层，吸取单个核细胞。置入另一短中管中，加入5 倍以上体积的Hank's液或RPMI1640，1500 rpm×10 分钟，洗涤细胞两次。
5. 末次离心后，弃上清，加入含有10 ％小牛血清的RPMI1640，重悬细胞。取一滴细胞悬液与一滴0.2 ％台盼兰染液混合，于血球计数板上，计数四个大方格内的细胞总数。
6. 细胞活力检测
死的细胞可被染成兰色，活细胞不着色。计数200个淋巴细胞。计算出活细胞百分率。
2. 取肝素抗凝静脉血与等量Hank's液或RPMI1640充分混匀，用滴管沿管壁缓慢叠加于分层液面上，注意保持清楚的界面。水平离心2000 rpm×20 分钟。
3. 离心后管内分为三层，上层为血浆和Hank's液，下层主要为红细胞和粒细胞。中层为淋巴细胞分离液，在上、中层界面处有一以单个核细胞为主的白色云雾层狭窄带，单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞。此外，还含有血小板。
4. 用毛细血管插到云雾层，吸取单个核细胞。置入另一短中管中，加入5 倍以上体积的Hank's液或RPMI1640，1500 rpm×10 分钟，洗涤细胞两次。
5. 末次离心后，弃上清，加入含有10 ％小牛血清的RPMI1640，重悬细胞。取一滴细胞悬液与一滴0.2 ％台盼兰染液混合，于血球计数板上，计数四个大方格内的细胞总数。
4个大方格内细胞总数
单个核细胞浓度（细胞数/1 毫升细胞悬液）＝────────×104×2（稀释倍数）
4
6. 细胞活力检测
死的细胞可被染成兰色，活细胞不着色。计数200个淋巴细胞。计算出活细胞百分率。
活细胞数
活细胞百分率＝────── ×100 ％
总细胞数
用本法分离PBMC，纯度在90 ％以上，收获率可达80～90 ％，活细胞百分率在90 ％以上。
注意事项
1. 抽取人外周静脉血时要注意无菌操作。
2. 操作全程应尽可能短时间内完成，以免增加死细胞数。
3. 用淋巴细胞分离液分离PBMC时，离心机转速的增加和减少要均匀、平稳，使保持清晰的界面。
4. 小鼠、兔等动物淋巴细胞比重与人不同，配制相应密度的Percoll或不同比例的聚蔗糖和泛影葡胺。
2. 操作全程应尽可能短时间内完成，以免增加死细胞数。
3. 用淋巴细胞分离液分离PBMC时，离心机转速的增加和减少要均匀、平稳，使保持清晰的界面。
4. 小鼠、兔等动物淋巴细胞比重与人不同，配制相应密度的Percoll或不同比例的聚蔗糖和泛影葡胺。
常见问题
一、附录
1. Hank's液（无Ca2＋、Mg2＋）配制法
NaCl 8.0 克，KCl 0.4 克，Na2HPO4·12H2O 0.12 克，KH2HPO40.06 克，葡萄糖1.0 克，双蒸水1000 毫克，1％酚红液2 毫克
将上列成分混合后溶化，分装于500 毫升盐水瓶内，8 磅15 分钟灭菌，4 ℃冰箱保存，临用时调PH至7.3～7.6。
2. 细胞分层液配制法
9 ％聚蔗糖24 份，34 ％泛影葡胺10 ％
混合，测比重为1.077～1.078，G5玻璃滤器过滤除菌。4 ℃冰箱保存备用。
3. 磷酸缓冲液（PB）
原液
A液
0.2 M NaH2PO4溶液，NaH2PO4 27.6 克，或NaH2PO4·2H2O 31.2 克，蒸馏水，溶解至1000 毫升
B液
0.2 M Ha2HPO4溶液，Ha2HPO4·12H2O 71.6 克，蒸馏水溶解至1000 毫升
各种不同PH值PB的配法
举例
0.1 M PH7.2PB
4. 血球保存液
葡萄糖2.05 克，枸椽酸钠0.8 克，氯化钠0.42 克，蒸馏水100 毫升
将上述成分混匀，略加温使其溶解，分装小瓶（100毫升）。经10 磅、10 分钟高压灭菌。4 ℃保存备用。
5. 培养液配置
（1）RPMI-1640培养液
（2）不完全RPMI-1640培养液
（3）完全RPMI-1640培养液
1. Hank's液（无Ca2＋、Mg2＋）配制法
NaCl 8.0 克，KCl 0.4 克，Na2HPO4·12H2O 0.12 克，KH2HPO40.06 克，葡萄糖1.0 克，双蒸水1000 毫克，1％酚红液2 毫克
将上列成分混合后溶化，分装于500 毫升盐水瓶内，8 磅15 分钟灭菌，4 ℃冰箱保存，临用时调PH至7.3～7.6。
2. 细胞分层液配制法
9 ％聚蔗糖24 份，34 ％泛影葡胺10 ％
混合，测比重为1.077～1.078，G5玻璃滤器过滤除菌。4 ℃冰箱保存备用。
3. 磷酸缓冲液（PB）
原液
A液
0.2 M NaH2PO4溶液，NaH2PO4 27.6 克，或NaH2PO4·2H2O 31.2 克，蒸馏水，溶解至1000 毫升
B液
0.2 M Ha2HPO4溶液，Ha2HPO4·12H2O 71.6 克，蒸馏水溶解至1000 毫升
各种不同PH值PB的配法
───────────────────────────────────────
PH 7.0 7.2 7.4 7.6 7.8 8.0
───────────────────────────────────────
A液（ml） 39.0 28.0 19.0 13.0 8.5 5.5
B液（ml） 61.0 72.0 81.0 87.0 91.0 94.5
───────────────────────────────────────
举例
0.1 M PH7.2PB
A液28 毫升，B液72 毫升，加蒸馏水100 ml
4. 血球保存液
葡萄糖2.05 克，枸椽酸钠0.8 克，氯化钠0.42 克，蒸馏水100 毫升
将上述成分混匀，略加温使其溶解，分装小瓶（100毫升）。经10 磅、10 分钟高压灭菌。4 ℃保存备用。
5. 培养液配置
RPMT-1640（FLOW公司出品）1 袋，三蒸水1000 毫升，电磁搅拌30 分钟：1N HCl 调PH7.2～7.4（约加2.5 毫升），过滤除菌，作无菌试验，4 ℃保存。
（2）不完全RPMI-1640培养液
RPMI-1640 95 毫升，0.1M丙酮酸钠 1 毫升，0.2 M谷氨酰胺 1 毫升，1 M Hepes 1 毫升，7.5 ％ NaHCO3 1 毫升，青霉素、链霉素（各1万单位）1 毫升
（3）完全RPMI-1640培养液
不完全1640培养液90 毫升，灭活胎牛（或新生牛）血清10 毫升
来源：丁香实验
