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        Percoll不连续密度梯度沉淀法分离纯化淋巴细胞和淋巴母细胞

        相关实验:细胞分离纯化技术

        最新修订时间:

        原理

        Percoll是一种包有乙烯吡咯烷酮的硅胶颗粒。渗透压很低(<20 mosm/kg H2O), 粘度也很小,可形成高达1.3 g/ml密度,采用预先形成的密度梯度时可在低离心力(200~1000 g)于数分至数十分钟内达到满意的细胞分离结果。由于Percoll扩散常数低,所形成的梯度十分稳定。此外,Percoll不穿透生物膜,对细胞无毒害,因此广泛用于分离细胞、亚细胞成分、细菌及病毒,还可将受损细胞及其碎片与完好的活细胞分离。

        材料与仪器

        实验材料
        试剂、试剂盒
        仪器、耗材

        步骤

        1.  不同浓度(密度)Percoll溶液的制备

        先用9 份Percoll与1 份8.5 % NaCl或1.5 MPBS混
        合达到生理性渗透压,然后用生理溶液(0.85 % NaCl或0.15 M PBS)稀释到所需浓度。

        Percoll浓度(%) 70   60     50   40        30       20
        比重(g/ml)  1.090      1.077       1.067        1.056         1.043         1.031

        2.  不连续密度梯度Percoll层的制备

        先将试管壁用牛血清湿润,除去多余血清,这
        种预处理可使逐层叠加的Percoll液平稳沿管壁流下,使形成满意的界面。在制备过程中一般用长针头注射器从高密度向低密度逐层放置,有时相邻两层Percoll比重相差不大时,可将Percoll液放入注射器中,小针头斜面紧贴管壁,任其自然慢慢流下。
          
        3.  装样

        样品体积和细胞浓度根据不同细胞而异,一般加样体积不宜过大,
        细胞浓度也不可过高,否则会影响细胞的分离和回收。
          
        4.  离心

        一般采用离心力为400 g,时间20~25 min。由于多层Percoll之间密度
        差别不大,因此离心机加速、降速时要慢,要平稳。
         
        5.  取样

        当所要分离的细胞绝大部分在两层的界面时,可逐层去除Percoll液后收集界面部位的细胞;有时大部分细胞位于Percoll层中,则需要逐层收集。收获含有
        Percoll液的细胞经2 次洗涤后可供培养或检测用。

        常见问题

        一、分离纯化细胞举例
          
        1.  富含NK活性大颗粒淋巴细胞(LGL)的纯化

        按顺序由下向上逐层加50 %、
        47.5 %、45 %、42.5 %和40 %五种不同密度的Percoll,如用10 ml试管(或塑料管)分离,每层Percoll约1.2~1.5 ml,初步从外周血中分离的PBMC细胞1×108悬于1 ml培基中,按要求装样、离心和取样。一般富含NK杀伤活性的LGL细胞位于42.5%与45%Percoll界面以及上下二层的Percoll液中。
          
        2.  纯化淋巴母细胞和除去死细胞

        分别叠加50 %和30 %Percoll液。收取经PHA(
        或其它抗原、有丝分裂原)刺激PBMC,或含有较高比例异型的PBMC(如肾综合征出血热患者),按要求装样、离心和取样。位于管底的淋巴细胞为小淋巴细胞;两层Fercoll之间为淋巴母细胞,纯度和回收率在80%以上,位于30 %Percoll表面是死细胞。收获淋巴母细胞可进行表型、结构以及功能的研究。

        二、人不同血细胞的漂浮密度
         
        人不同血细胞的漂浮密度

        细 胞       漂浮密度        
        红细胞         1.09-1.11 
        粒细胞   
        嗜酸性         1.09-1.095 
        嗜中性         1.080-1.085   
        单核细胞        1.050-1.066
        血小板         1.030-1.060
        淋巴细胞      1.052-1.077
        B淋巴细胞      1.062-1.075  
        T淋巴细胞      1.065-1.077
        淋巴母细胞     1.065-1.077
        自然杀伤细胞    1.050-1.070   
         

        来源:丁香实验

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