免疫斑点试验(Dot Immunobinding Assay, DIBA)

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　　免疫斑点试验(Dot Immunobinding Assay, DIBA)是利用硝酸纤维素膜(N、C或醋酸纤维素膜作为固相支持物，进行抗原 抗体反应的免疫学检测方法。该法具有微量、快速、经济、方便等特点，可用于检测抗体或抗原。近年来已较多地应用于医学基础研究和疾病的诊断。
　　(一)　免疫 斑点试验的基本原理
　　硝酸纤维素膜和醋酸纤维素膜具有很强的静电吸附力，在中性条件下即可有效地吸附蛋白质等生物大分子 。因而，将抗原吸附于纤维素膜后，就可利用纤维素膜作为固相进行抗原抗体反应。当加入抗体后(即可与膜上的抗原结合，犎;后再加入带有标记物的抗体，使标记通过抗抗体和相应抗体的结合间接地交联于纤维素膜上。加入标记物相应的底物后，标记物即可与底物作用形成不溶性产物,呈现斑点状着色,从而判定结果。根据所用的标记物不同，可分为：辣根过氧化物酶免疫斑点试验（使用辣根过氧化物酶作为抗抗体的标记物)，碱性磷酸酶免疫斑点试验(使用硷性磷酸酶抗硷性磷酸酶复合物作为酶标记物)和金银染色免疫斑点试验(使用胶体金作为抗抗体的标记物)等。其中，最常用的是以辣根过氧化物酶标记系统为基础的免疫斑点试验。下面以辣根过氧化物酶免疫斑点试验和碱性磷酸酶免疫斑点试验为例作一简单介绍。
　　(二)　免疫斑点试验的基本步骤
　　方法一　辣根过氧化物酶免疫斑点试验
　　　　　　　将0.01M PBS PH7.4 稀释的抗原液2μl
　　　　　　　点于硝酸纤维素膜(或醋酸纤维素膜)上
　　　　　　　　　　　　　　　↓
　　　　　　　　　置37℃温箱中干燥20～30分钟
　　　　　　　　　　　　　　　↓
　　　　　　　　滴加封闭液37℃温盒中封闭10分钟
　　　　　　　　　　　　　　　↓
　　　　　　　　　用洗涤液洗1～2次，滤纸吸干
　　　　　　　　　　　　　　　↓
　　　　　　　加用稀释液稀释的抗体或待检标本，置
　　　　　　　　　　　37℃湿盒中30分钟
　　　　　　　　　　　　　　　↓
　　　　　　　　　用洗涤液震洗3次×3分钟、吸干
　　　　　　　　　　　　　　　↓
　　　　　　　水洗终止反应，观察结果。出现明显综
　　　　　　　　　　　　色斑点者为阳性
　
　
　　方法二　碱性磷酸酶免疫斑点试验
　　　　　　　将0.01M PBS PH7.4 稀释的抗原液2μl
　　　　　　　　　　点于硝酸纤维素膜上
　　　　　　　　　　　　　　　↓
　　　　　　　　　置37℃温箱中干燥20～30分钟
　　　　　　　　　　　　　　　↓
　　　　　　　　用封闭液37℃湿盒中封闭10分钟
　　　　　　　　　　　　　　　↓
　　　　　　　　用洗涤液震洗1～2次，滤纸吸干
　　　　　　　　　　　　　　　↓
　　　　　　　加稀释液稀释的小鼠抗体或待检标本，
　　　　　　　　　　置室温湿盒中30分钟
　　　　　　　　　　　　　　　↓
　　　　　　　　　用洗涤液震洗3次×3分钟，吸干
　　　　　　　　　　　　　　　↓
　　　　　　　加1∶50稀释的兔抗鼠IgG或羊抗鼠IgG血清，
　　　　　　　　　置室温湿盒中30分钟、洗同前、吸干
　　　　　　　　　　　　　　　↓
　　　　　　　加APAAP复合物于膜上、室温湿盒中30分
　　　　　　　　　　　　钟，洗同前、吸干
　　　　　　　　　　　　　　　↓
　　　　　　　加1∶50稀释的抗鼠IgG血清，置室温湿
　　　　　　　　　　盒中10分钟，震洗1次、吸干
　　　　　　　　　　　　　　　↓
　　　　　　　　加APAAP复合物，温育、洗涤同“9”
　　　　　　　　　　　　　　　↓
　　　　　　　　　重复“9”和“10”1～3次
　　　　　　　　　　　　　　　↓
　　　　　　　　　洗涤液震洗3次×3分钟、吸干
　　　　　　　　　　　　　　　↓
　　　　　　　滴加新配底物溶液显色5～10分钟，水洗中
　　　　　　　止反应，观察结果
　　(三)主要材料与试剂
　　1.　硝酸纤维素膜(N、C)：浙江黄岩人民化工厂出品。
　　2.　洗涤液：含0.5％Tween20的0.01M PBS PH7.4
　　　　0.2M Na２HPO４　87ml ┐
　　　　0.2M Na２HPO４　13ml │
　　　　　　　　NaCl 15.2g　 │─-→加H２O至2000ml
　　　　　　　Tween 20　6ml　┘
　　3.　封闭液(抗体稀释液)：
　　1M　D-glucose 19.817g
　　2ml 甘油(2％)
　　加含0.35％ T20的0.01M　PBS至100ml
　　4.　辣根过氧化物酶底物溶液
　　　DAB　　　　　　　　　5mg ┐用前取1ml
　　　0.05M PH7.6 Tris-HCl 10ml┘
　　　加3％H２O２　0.01ml
　　5.　硷性磷酸酶抗硷性磷酸酶复合物(APAAP复合物)
　　6.　硷性磷酸酶底物溶液
　　(四)　免疫斑点试验的影响因素
　　1.　包被N、C膜的抗原浓度对试验结果影响较大。多以蛋白质含量500～1000μg／ml为宜。浓度过高可出现假阳性，过低则降低试验的敏感性。
　　2.　酶结合物浓度对试验成功与否至关重要。最适浓度常与包被抗原浓度有关，应根据试验具体条件作方阵滴定来确定。
　　3.　显色时间，一般认为5-10分钟较好。显色时间过长常导致本底着色加深，降低试验的特异性。
　　4.　用抗原包被NC检测抗体时，待检样品加样不宜过多。加样过多可使相邻的样品混淆，一般5～10μl即可。