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        质粒提取

        相关实验:含有目的基因真核表达 pEGFP-C1 载体的构建实验

        最新修订时间:

        材料与仪器

        步骤

        1.  挑取含有目的DNA重组体的单个菌落接种在3 ml LB(含有Amp或Kan)液体培养基中,37 ℃,225 rpm培养12~16 hrs。
         
        2.  提取质粒
         
        ⑴离心菌液,废弃上清。
         
        ⑵加入250 ul Buffer P1,使菌片重悬,务必使片状物不可见。
         
        ⑶加入250 ul Buffer P2,上下颠倒EP管4~6次,操作时间要少于5 min。
         
        ⑷加入350 ul BufferN3,上下颠倒EP管4~6次,可见絮状沉淀。
         
        ⑸离心13000 rpm,10 min。
         
        ⑹离心后的上清液移入PrepSpinColumn。
         
        ⑺13000 rpm离心30~60Secs,弃滤液。
         
        ⑻加入0.5 mlBufferPB,13000 rpm离心30~60 Secs,弃滤液。
         
        ⑼加入0.75 mlBufferPE,13000 rpm离心30~60 Secs,弃滤液。
         
        ⑽13000 rpm再离心1 min,弃滤液。
         
        ⑾将PrepSpinColumn加到新的1.5 mlEP管上。
         
        ⑿加50 ul BufferEB至滤膜中央,室温静置1 min,13000 rpm离心1 min。即获得所需质粒。
         
        3.  酶切鉴定
         
        反应体系(20 ul 体系):
         
        质粒提取
         
        反应条件:37 ℃ 2-3 hrs
         
        4.  电泳:观察酶切结果。

        来源:丁香实验

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