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        CaCl2转化法

        最新修订时间:

        原理

        细菌处于0℃,CaCl2的低渗溶液中,菌细胞膨胀成球形,质粒DNA或重组DNA粘附在细菌细胞表面,经过42°C短时间的热击处理,促进吸收DNA,然后在非选择培养基中培养一代,待质粒上所带的抗菌素基因表达,就可以在含抗菌素的培养基中生长。

        材料与仪器

        实验材料
        试剂、试剂盒
        仪器、耗材

        步骤

        1.  接种一个单菌落于50 ml LB培养液中,于37℃摇床培养过夜(250 r/min)。

        2.  往一个2 L 的烧瓶中加入400 ml LB培养液,再加入4  ml 过夜培养液,于37℃;摇床,培养至OD590为0.375。

        3.  将培养液分装到8个50 ml 预冷无菌的聚丙烯管中,于冰上放置5~10 min,然后于4℃,1 600 g 离心7 min。
         
        4.  细胞沉淀用10 ml 冰冷的CaCl2溶液重悬,于4℃,以1 100 g 离心5 min 。

        5.  细胞沉淀用10 ml 冰冷的CaCl2溶液重悬,冰上放置30 min,于4℃,1 100 g 离心5 min。
         
        6.  用2 ml  冰冷的CaCl2溶液重悬各管细胞,然后按每管250 ul 的量分装于预冷的无菌聚丙烯管中,立即冻存于- 70℃。

        7.  按照以下各步骤用10 ng pBR322转化100 ul 感受态细菌。

        8.  将合适体积的转化物涂于含有氨苄青霉素的LB平板上,37℃培养过夜。

        9.  将10 ng 加入到一个15 ml 无菌的圆底试管中,并放置冰上。

        10.  将盛有感受态细胞菌的管子握在手上使菌液迅速熔化。

        11.  立即将100 ul 感受态细菌加 入到管中,轻轻旋动,并放置冰上10 min 。

        12.  将管故入42℃水浴2 min 进行热休克,然后加入1 ml LB 培养液于每一支试管中。

        13.  于37℃置滚筒式摇床口培养1 h。

        14.  将几个稀释度菌液涂布于含合适抗生素的平板上,于37℃培养12~16 h。

        注意事项

        1.转化菌涂平板前抗生素的量要足够,涂布细菌时菌量不要太多,培养时间不要超过16小时。否则抗生素会失效,未转化菌也会生长。


        2.制备感受态细胞的过程中,每一步操作的动作要轻柔,尤其是悬浮细胞时要避免用旋祸混合器。


        3.所用的CaCl2等试剂均需是最高纯度的,并用最纯净的水配制,最好分装保存于4℃。


        4.整个操作过程均应在无菌条件下进行。

        来源:丁香实验

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