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        热击法

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        原理

        质粒DNA或重组DNA粘附在细菌细胞表面,经过42摄氏度短时间的热击处理,促进吸收DNA.然后在非选择培养基中培养一代,待质粒上所带的抗菌素基因表达,就可以在含抗菌素的培养基中生长。

        材料与仪器

        步骤

        一、实验材料准备

        1.  器材
         
        旋涡混合器,微量移液取样器,移液器吸头,1.5 ml 微量离心管,双面微量离心管架,干式恒温气浴(或恒温水浴锅),制冰机,恒温摇床,培养皿(已铺好固体LB-Amp),超净工作台,酒精灯,玻璃涂棒,恒温培养箱。
         
        2.  试剂
         
        培养基(不加抗菌素),LB培养基(加抗菌素),无菌ddH2O,IPTG,X-gal。
         
        3.  材料处理

        无菌ddH2O,1.5 ml 离心管装入铝制饭盒(灭菌)、移液器吸头装入相应的吸头盒(灭菌),20%IPTG(M/V),2% X-gal(M/V,用N,N-二甲基甲酰胺配)。
         
        二、操作步骤
         
        1.  事先将恒温水浴的温度调到42℃。
         
        2.  从-70℃ 超低温冰柜中取出一管(100 ul)感受态菌,立即用手指加温融化后插入冰上,冰浴5~10 min。
         
        3.   加入5 ul 连接好的质粒混合液(DNA含量不超过100 ng),轻轻震荡后放置冰上20 min。
         
        4.  轻轻摇匀后插入42℃水浴中1~2 min进行热休克,然后迅速放回冰中,静置3~5 min。
         
        5.  在超净工作台中向上述各管中分别加入500 ul LB培养基(不含抗菌素)轻轻混匀,然后固定到摇床的弹簧架上37℃震荡1 h。
         
        6.  在超净工作台中取上述转化混合液100-300 ul,分别滴到含合适抗菌素的固体LB平板培养皿中,用酒精灯烧过的玻璃涂布棒涂布均匀。
         
        7.  如果载体和宿主菌适合蓝白斑筛选的话,滴完菌液后再在平板上滴加40 ul 2% X-gal,8 ul 20% IPTG,用酒精灯烧过的玻璃涂布棒涂布均匀。
         
        8.  在涂好的培养皿上做上标记,先放置在37℃恒温培养箱中30~60 min 直到表面的液体都渗透到培养基里后,再倒置过来放入37℃恒温培养箱过夜。
         
        9.  在被细菌污染的桌面上喷洒70%乙醇,擦干桌面,写实验报告。
         
        10.  观察平板上长出的菌落克隆,以菌落之间能互相分开为好。注意白色菌斑。

        注意事项

        1. 电击之前保持低温状态。


        2.电击杯使用完,用针头蒸馏水反复冲洗杯底,再用70%乙醇浸泡,4℃存放,使用前烘干即可,或者烘干后,-20℃冰箱存放。


        3.玻璃涂布棒上的酒精熄灭后稍等片刻,待其冷却后再涂。


        来源:丁香实验

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