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        毕氏酵母氯化锂转化法

        互联网

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        试剂

        1M LiCl <用去离子蒸馏水配制,0.22um滤膜过滤除菌;必要时用消毒去离子水稀释>

        50% PEG3350 <Sigma P3640  用去离子蒸馏水配制,0.45um滤膜过滤除菌,用较紧的盖子的瓶子分装>(氯化锂转化法只能PEG3350,不能用PEG8000,PEG3350在北京莱博生物有售,80元/100克)

        2mg/ml salmon sperm DNA / TE(10mM Tris-Cl, pH8.0, 1.0mM EDTA)-20℃保存

        注:醋酸锂对毕氏酵母无效,对酿酒酵母有效,仅氯化锂有效;PEG3350可屏蔽高浓度LiCl的毒害作用。

        感受态毕氏酵母的制备

        1. 接种Pachia pastoris到50ml YPD培养基中,30℃摇菌过夜(约24~28h)培养到OD值为0.8~1.0(约108 Cells/ml);培养基里有流沙样的菌体在流动

        2. 收获细胞,用25ml无菌水洗涤一次,室温下1500g离心10min;

        3. 重悬细胞于1ml 100mM LiCl溶液中,将悬液转入1.5ml离心管;

        4. 离心机最大速度离心15秒沉淀菌体,重悬菌体于400ul 100mM LiCl溶液中;

        5. 按50ul/管分装,立即进行转化;

        注:不要将感受态酵母菌冰浴;

        毕氏酵母的转化

        1. 煮沸1ml鲑鱼精DNA 5min,迅速冰浴以制备单链担体DNA;鲑鱼精DNA主要是防止目的基因的降解,协助目的基因的转化

        2. 将感受态酵母菌离心,以Tips去除残余的LiCl溶液;

        3. 对于每一个转化,按以下顺序加入:

        50% PEG3350                      240ul

        1M LiCl                           36ul

        2mg/ml 单链Salmon sperm DNA       25ul

        5~10ug/50ul H2O 质粒DNA          50ul

        4. 剧烈旋涡混匀直至沉淀菌体完全分布均匀(约1min);

        5. 30℃水浴孵育30min;

        6. 42℃水浴热休克20~25min;

        7. 6000~8000rpm离心收集酵母菌体;

        8. 重悬酵母于1ml YPD培养基,30℃摇床孵育;

        9. 1~4h后,取25~100ul菌液铺选择性培养基平板,于30℃培养2~3天鉴定;

        毕氏酵母PEG1000转化法

        试剂

        缓冲液A:1.0M Sorbitol,10mM Bicine,pH8.35(sigma),3%(v/v)ethylene glycol

        缓冲液B:40%(w/v)PEG1000(sigma),0.2M Bicine,pH8.35

        缓冲液C:0.15M NaCl,10mM Bicine,pH8.35

        未污染的新鲜、试剂级DMSO,-70℃保存

        注:1. 缓冲液A、B、C均用滤膜过滤,-20℃保存;

        2. 将DNA直接加在冻结的酵母细胞上是本实验的关键之处(即使在冰上解冻的待转化细胞,其摄取外源DNA的能力也在解冻过程中迅速下降;如进行多样品的转化,建议按6样品/组进行);

        待转化毕氏酵母的制备

        1. 接种环接种Pachia pastoris于YPD平板,30℃培养2d;

        2. 挑取单克隆酵母菌株于10mlYPD培养基中,30℃振荡培养过夜;

        3. 取步骤2中小量菌液接种到100mlYPD培养基中振荡培养,待其OD值从0.1升到0.5~0.8;

        4. 室温下3000g离心收集酵母菌体,50ml缓冲液A洗涤一次;

        5. 重悬菌体于4ml缓冲液A中,按0.2ml/管分装于1.5ml的离心管中,每管加入11ulDMSO,混合后迅速于液氮中冷冻,

        6. -70℃保存

        毕氏酵母的转化

        1. 将约50ug线性化质粒DNA溶于20ul TE或水中,直接加于冻结的酵母细胞中;加入担体DNA(40ug变性超声线性化鲑鱼精DNA)以获得最大转化率;

        2. 37℃水浴孵育5min,中间混合样品1~2次;

        3. 取出离心管,加入1.5ml缓冲液B,彻底混匀;

        4. 30℃水浴孵育1h;

        5. 室温下2000g离心10min,去除上清液,菌体沉淀重悬于1.5ml缓冲液C中;

        6. 离心样品,去除上清液,轻微操作将样品重悬于0.2ml缓冲液C中;

        7. 将所有转化液铺于选择性平板,于30℃孵育3~4天后,鉴定;

        毕赤酵母转化方法最常用的是电转化法和原生质体法,其中电转化法最为方便,转化效率最高,最容易产生多拷贝整合。由于原生质体法必须首先制备去除细胞壁的原生质体细胞以利于DNA 进入,然后细胞再生细胞壁,产生转化体,而ZeocinR 抑制细胞壁的形成,导致不能产生转化体。因此利用ZeocinR 作为选择标记的载体如p PICZ 系列,不能使用原生质体法进行转化。

         

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