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        PCR扩增法

        相关实验:多药抗药基因的表达实验

        最新修订时间:

        原理

        大多MDR细胞膜上出现MDR-1基因及其基因产物P-糖蛋白过度表达。 多药抗药基因的表达实验是通过反转录和PCR的方法来检测这些特定基因的过度表达。

        材料与仪器

        步骤

        一、细胞总RNA提取

        1.  收集约5x107个细胞,冷PBS洗涤。

        2.  加入400 ul RNA提取液(含6 mol/l 的异硫氰酸肽,0.5%十二烷基肌酸钠,0.025 mol/l 构橼酸钠pH7.0,0.25 mol/l 乙酸钠,pH4.0,0.5%二疏基乙醇,50%萘酸),混匀。

        3.  加入400 ul 氯仿,混匀,以13 000 r/min 于4℃离心15 min。

        4.  取上清液加入等体积的异丙醇,4℃放置30 min。

        5.  然后以13 000 r/min 离心15 min,吸上清,将RNA成点用75%的乙醇洗涤1次,溶于100 ul 的无菌双蒸馏水中。

        6.  并用紫外分光光度计检测RNA纯度(A260/A280应为1.8~2.0)后备用。

        二、反转录及PCR扩增

        1.  引物
         

        PCR扩增法


        2.  取细胞总RNA10 ul 加入20 ul AMV逆转录酶反应体系中,42℃保温30 min 进行反转录,合成cDNA。

        3.  然后置95℃,3 min 终止反转录。

        4.  接着在Taq酶的作用下,用mdr-1和β2-MG引物,对cDNA上的目的片段进行PCR

        5.  94℃预变性2 min,然后94℃变性1 min,50℃退火1 min,72℃延伸1 min,扩增35个循环。

        6.  最终在60℃保温7 min,以保证产物充分延伸。

        7.  取10 ul 扩增产物在3%琼脂糖凝胶电泳后,紫外灯下照相,与mdr-1 cDNA阳性对照,等位的DNA条带为阳性,反之为阴性。

        注意事项

        1. 尽可能在低温下操作;


        2. 适量斟酌Trizon等的用量;


        3. 在每一次离心后除尽蛋白质、不溶物

        提取操作时必须戴手套、口罩等防止DNA酶的影响;


        4. 注意Trizon带有腐蚀性;


        5. 最重要的就是防止DNase的污染,手套、口罩必不可少,所用的枪头和EP管等也要RNA提取专用的,无DNA酶的。

        来源:丁香实验

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