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        PCR扩增DNA

        互联网

        12163

        【实验目的】
        1.掌握PCR扩增DNA的技术及原理
        2.学习PCR扩增仪的使用

        【实验原理】
        聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)是一种体外DNA扩增技术,1985年由Mullis等人创立。该技术能在几小时的实验操作中,将人为选定的一段DNA扩增几百万倍,具有灵敏度高、特异性强、操作简便和应用广泛等优点,目前已成为分子生物学及基因工程中极为有用的研究手段,另外在医学研究和医疗诊断中亦体现出极大的应用价值。

        PCR的工作原理类似于DNA的体内复制过程,是将待扩增的DNA片断和与其两侧互补的寡核苷酸链引物经变性、退火及延伸三步反应的多次循环,使特定的DNA片断在数量上呈指数增加。PCR扩增首先需要一对引物,根据待扩增区域两侧的已知序列合成两个与模板DNA互补的寡核苷酸作为引物,引物序列将决定扩增片段的特异性和片段长度。反应体系由模板DNA、一对引物、dNTP、耐高温的DNA聚合酶、酶反应缓冲体系及必须的离子等所组成。

        PCR反应循环的第一步为加热变性,使双链模板DNA变性为单链;第二步为复性,每个引物将与互补的DNA序列杂交;第三步为延伸,在耐高温的DNA聚合酶作用下,以变性的单链DNA为模板,从引物3ˊ端开始按5ˊ→3ˊ方向合成DNA链。这样经过一个周期的变性——复性——延伸等三步反应就可以产生倍增的DNA,假设PCR的效率为100%,反复n周期后,理论上就能扩增2n倍。PCR反应一般30-40次循环,DNA片段可放大数百万倍。

        常规PCR反应用于已知DNA序列的扩增,变性温度为95℃,复性温度为37℃~55℃,延伸合成温度为72℃,DNA聚合酶为Taq酶(可耐受95℃左右的高温而不失活),反应循环数为30。

        【实验材料】
        1.实验器材
        PCR扩增仪,台式高速离心机,移液器,经高压灭菌后的Eppendorf管,电泳仪。

        2.实验 试剂
        (1)模板DNA(0.1µg/µl):用牙签挑取单菌落悬浮到50µl的裂解液中(裂解液1%TritonX-100,20mmol/l Tris-HCl PH 8.2, 2mmol/l EDTA), 95℃温浴10分钟, 10000rpm离心5分钟,取2µl上清液用于总体积50µl的PCR反应。
        (2)TaqDNA聚合酶(5U/µl),10×扩增缓冲液,dNTP(1mmol/L):购买
        (3)引物(100pmol/L):设计并合成与目的DNA两侧互补的引物内。

        【实验操作】
        1.准备PCR反应溶液
        (1) 按以下次序,将下列成分在0.5ml灭菌Eppendorf管内混合:
        10×扩增缓冲液 10µl
        4×dNTPs(包括四种dNTP) 8µl
        引物1 1µl
        引物2 1µl
        模板DNA 1µl (10ng)
        Taq DNA聚合酶 1µl (2.5U)
        加水至终体积 100µl
        (2) 用手指轻弹Eppendorf管底部,使溶液混匀。在台式 离心机 中离心2秒以集中溶液于管底。
        (3)加石蜡油50µl封住溶液表面。

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